微生物及酶工程制药-复习2.doc

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1、二、问答4.　如何从环境中筛选稀有放线菌中的小单孢菌，并说明各步骤的作用？（一）所谓的稀有放线菌：即为除链霉菌属外的其它属的放线菌。如：小单孢菌、小双孢菌、马杜拉放线菌等。选择培养分离——微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：（1）抑制大多数其它微生物的生长。（2）使待分离的微生物生长更快。→使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。（3）使待分离的微生物生长“突出”。→直接挑取分离的微生物的菌落获得纯培养。1）①利用选择培养法进行直接分离：Ⅰ、高温下培养：分离嗜热细菌。Ⅱ、培养基中不含N：分离固氮菌。Ⅲ、培养基加抗生素：分离抗性菌

2、。②利用选择平板进行直接分离：Ⅰ、牛奶平板：分离蛋白酶产生菌。Ⅱ、颜色反应：分离特定的菌株。Ⅲ、利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化。2）富集培养：特定的环境条件→仅适应于该条件的微生物旺盛生长→待分离微生物在群落中的数量大大增加→从自然界中分离到所需的特定微生物（二）高选择性分离小单孢菌的程序：土样自然风干→制成土壤悬浮液→1~5%苯酚处理→涂布平板（HV琼脂+萘啶酸20mg/L+衣霉素20mg/L）衣霉素和萘啶酸作为细菌、真菌和非目的放线菌的抑制剂。6.　如何利用同位素标记法研究微生物药物生物合成的机理？将同位素标记可疑前体物质加到培养基中→培养后分离目

3、的代谢产物→测定终产物中同位素含量和分布情况→判断可疑前体物质是否参与代谢产物的合成16.　如想开发生产葡萄糖苷酶的基因工程菌，该如何构建？如想进一步提高该酶的表达量，该如何进行？假如重组表达的酶以包涵体形式存在，以你学到的知识分析应该采取什么措施？基因工程酶（蛋白）的构建（1）基因的获取（通过NCBI搜索欲构建的葡萄糖苷酶的基因序列，再设计引物，以所需的cDNA为模板PCR获得）。（2）目的基因与表达载体的体外重组。（3）导入宿主细胞。（4）筛选和验证。（5）目的基因的表达。提高表达量：（1）利用高效表达质粒（强启动子和高拷贝）。（2）优化密码子。（3）

4、优化翻译起始区的二级结构。（4）使ATG和SD序列之间距离为9bp。（5）优化表达条件。减少包涵体：（1）降低培养温度。（2）减少诱导剂的使用量。（3）12.　论述抗生素的作用机理？（1）抑制细菌细胞壁的合成。（2）增加细菌细胞膜的通透性。（3）抑制细菌蛋白质的合成。（4）抑制细菌核酸的合成。（5）干扰细菌的能量代谢。（6）增强吞噬细胞的功能。13.　从你的观点谈谈细菌耐药性的控制策略？（1）合理使用抗菌药物，加强对细菌耐药性的监测。（2）严格执行消毒隔离制度，应对耐药菌感染的患者隔离；避免医院内交叉感染。（3）加强药政管理，严格执行抗菌药物凭处方供应。（

5、4）加强新抗菌药物的研制。（5）加强质粒消除剂的研制。（6）抗菌药物的“轮休”有计划地将抗菌药物分期分批交替使用，对控制细菌耐药性有一定作用。15.　请简述微生物来源的抗肿瘤药物研发的一般过程。微生物药物研发的一般程序微生物药物研究的一般程序：（1）微生物药物产生菌、有效菌株的筛选、保藏及选育。（2）发酵。（3）药物的分离纯化。（4）药物的化学鉴别和结构测定。（5）药理与临床评价。（6）工业化研究。（7）基础研究。微生物药物研究开发的一般程序9.　在微生物制药的种子扩大培养过程中，需要考虑到哪些方面的问题？（一）种子培养的目的与要求：（1）种子扩培的目的：

6、1）接种量的需要。2）菌种的驯化。3）缩短发酵时间、保证生产水平。（2）种子的要求：1）活力强，移种至发酵后能够迅速生长，迟缓期短。2）生理状况稳定，个体与群体。3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。4）无杂菌污染。5）保持稳定的生产能力。（3）种子制备过程：斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵（二）种子制备的技术概要：（1）实验室阶段：1）培养物选择的原则：目的——种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为2类：①对于不产孢子和芽孢的微生物：获得一定数量和质量的菌体②对于产孢子的微生物：Ⅰ、获得一定数量和质量的孢子Ⅱ、获得一定数

7、量和质量的菌丝体2）培养基选择的原则：培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。培养基的原料一般都比较精细（实验室种子培养阶段，规模一般比较小，为了保证培养基的质量）3）起始接种物的传代问题：①细菌：保藏斜面→活化斜面②产孢子：保藏→母斜面→子斜面原则：使菌种的传代次数尽可能的少。***孢子培养：*母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去除变异株。所以接种时要稀一点，便于纯化生长到单菌落。*子瓶：大量繁殖，得到大量孢子。*接种：❶从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落。❷接种时密一点，得到大量的孢子。（2）生产车间阶段：1）培养物

8、的选择原则：菌丝体比孢子要有利——①缩短发酵时间②有利于获得好的发