高密度细胞库建立和灌注培养.doc

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1、一种新的细胞扩大方法使用高密度细胞库，一次性生物反应器和灌注技术byBenjaminWright,MikeBruninghaus,MikeVrabel^JasonWalther,NehaShah,Seul-ABae，TimothyJohnson，JinYin,WeichangZhou,andKonstantinKonstantinov一个典型的细胞培养过程从细胞解冻复苏开始，随后通过连续传代培养对细胞进行扩增，可选用的培养设备包括摇瓶、细胞培养转瓶、WAVE波浪袋生物反应器和机械搅拌生物反应器等（1）。当细胞培养体积和细胞密度达到预定标准时，细胞将转入到生物反应器中继续生长并表达

2、产物。这种方法冃前还而临着一些挑战。摇瓶和转瓶是细胞放大培养初期使用的主要设备，这两种设备都需要在超净工作台中手动操作，这种情况下容易出现污染，而H易受操作者失误影响。此外，传统的细胞库保存细胞时，冻存管内细胞数量较少，细胞在放大过程中耗时较长。生产用生物反应器体积非常大，需要许多中间型号的培养设备来将种子细胞按比例放大，这将导致需要更长的放大培养时间，并使情况变得更加复杂。生物反应器接种活细胞密度通常低于0.5x106cell/mL,接种细胞后需要培养生长5・10天。在细胞牛长期内，由于细胞密度达不到标准不能表达产物或产物含量低，这段时间不能产牛实用价值。有研究表明，建立高密度

3、细胞库可以减少细胞放大的步骤并提高细胞放大成功率。Taoetal.等人建立了高密度细胞库，每冻存管中活细胞量达到4.5x1（）8个，细胞复苏后直接接种到20匚的WAVE波浪袋生物反应器中（2）。这项研究表明，使用高密度细胞库可以减少中间摇瓶放大步骤并且节约9天的细胞扩大培养时间。Heidemannetal.等人使用高密度细胞库配合儿种不同大小的一次性生物反应器对细胞进行放大培养，减少了60-70%的培养时间（3）o一次性牛物反应器相比不锈钢牛物反应器具有许多优点，例如灵活性大大增强，节省安装、清洗和灭菌时间，减少资本投资等（4・6）.GE公司的一次性WAVE波浪生物反应器常常用于

4、种子细胞的扩大培养，该种反应器可以大大减少污染风险（通常不需要在层流罩下工作），而且不需要安装、清洗和灭菌等操作（7）o目前工业化生产中，细胞灌注培养越来越受到人们关注。一些公司已经成功的将细胞灌注培养用于商业化牛产中（9）。使用灌注培养可以在较小体积的牛物反应器中获得高的细胞密度（10）,相比批次培养和流加培养能更快的收获培养中的不稳定产物（11）o由于这些和其他特点，灌注培养常常在最终生产产品的生物反应器上使用，而不在细胞扩大过程中使用。Whitaker（12）andHeidemann⑶简单提及过灌注培养在细胞扩大过程中的应用,但他们没有讨论灌注培养在改进终端细胞种扩大、减小

5、生物反应器大小、减少生物反应器培养步骤和减少细胞在牛产用牛物反应器中细胞牛长阶段时间等方面的潜力。Pohlscheidt（13）使用了一台带有倾斜细胞沉降装置的3000L生物反应器进行细胞灌注培养，细胞密度达到15.8x1（）6个/mL,相比流加培养减少了20%的培养时间。然而，由于细胞分离器对流加速率的限制，细胞长期在次优的条件下生长，想要进一步提高细胞密度变得相当困难（10）o在这里，我们描述了一种新的细胞扩大方法，该方法需要使用到高密度细胞库、一次性波浪生物反应器和交替切向流（ATF）灌注培养技术。图1中比较了一个用常规方法将细胞扩大到500L牛产用生物反应器5）中的例子。

6、使用高密度细胞库方法减少了中间两个转瓶培养的步骤，可以直接接种到2L的波浪生物反应器中。使用波浪生物反应器（2L和20L）代替转瓶（125ml到10L）大大减少了需要在超净台中操作的次数。这种替换使整个过程在一个封闭系统中进行，提高了操作成功率。ATF灌注培养技术在ml级生物反应器（图中为带有ATF灌注装置的50L生物反应器）的应用能使细胞密度大于50x106个加

7、。这种细胞扩大方式将使得500L牛物反应器接种细胞密度达到5xl06^/ml,远远超过常规培养时的接种密度0.5X106个/ml。更高的接种细胞密度可以为500L生物反应器减少5天细胞生长时间，可以为500L生物反应器

8、生产线节省50天操作时间。Figure1:Comparingaconventionalwithanimprovedseed-trainprocessforinoculationofa500-Lperfusionbioreactor；thenewprocessuseshigh-density(HD)cellbanking,single-usetechnology,andhigh-densityperfusionatthen-1stagetoallowforhigh-densityi