电化学DNA传感器的研制.doc

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1、电化学DNA传感器的研制邹小勇，陈汇勇，罗利军，谭学才，蔡沛祥（中山大学，化学与化学工程学院，广州510275）指导老师：邹小勇副教授摘要：在固定电压下，将单链DNA固定在活化的碳糊电极（CPE）表面，以K3Fe(CN)6为指示剂，研究单链DNA电极（ss-DNA/CPE）、双链DNA电极（ds-DNA/CPE）的指示剂氧化峰电流变化，并研究了在一定电压下，DNA浓度与杂交时间对指示剂的电化学信号的影响。关键词：DNA,碳糊电极,电化学传感器；K3Fe(CN)6目前，电化学DNA传感器在DNA序列分析[1]、细茵及病毒感染类疾病诊断[2]、基因诊断[3]、药物的检测和筛选[4,5]、DNA损

2、伤研究[6]、环境监测[7,8]等方面被广泛应用，在生物医学领域有着非常重要的意义。1992年Maeda等人[9]研究了抗疟药阿的平在DNA修饰电极上的电化学检测，证实阿的平与DNA分子发生了强烈的特异性相互作用。1997年Wang[10]等人用氧化阳极法,将与结核杆菌(Mycobateriatuberculosis)基因DR区相对应的DNA探针,固定在碳糊电极表面，制成电化学DNA传感器。本文以碳糊电极（CPE）为基底电极，K3Fe(CN)6为杂交指示剂，在一定电压下将单链DNA固定在活化的电极表面，研制成电化学传感器。并采用了差分定量法初步探索了该传感器对互补序列DNA的识别和测定。1实

3、验部分1.1试剂与仪器1.1.1试剂DNA固定液：0.2mol/LHAc-NaAc缓冲液（pH=5.0）；DNA杂交液：0.75mol/LNaCl，0.02mol/L磷酸盐缓冲液（NaH2PO4.2H2O-Na2HPO4.12H2O）（pH=7）；指示剂底液为0.2mol/LHAc-NaAc缓冲液（pH=7），0.1mol/LKNO3；指示剂为1×10-3mol/LK3Fe(CN)6；石墨粉，液体石蜡为分析纯；其他试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。1.1.2材料单链DNA（ss-DNA）A:与HIV-1有关的短DNA序列，与B段完全互补，也称作互补链，由21个碱基组成，作为靶液；单链DN

4、A(ss-DNA)B:由21个碱基组成，用作探针。A、B序列分别为：A：5’-ACT-GCT-AGA-GAT-TTT-CCA-CAT-3’；B：5’-ATG-TGG-AAA-ATC-TCT-AGC-AGT-3’。以上材料均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.1.2仪器CHI660A电化学分析站；三电极体系：Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，碳糊电极为工作电极。1.2实验方法1.2.1碳糊电极的制作将6g石墨粉和2.5g液体石蜡混合均匀，在玛瑙研钵中充分研磨，直到得到颗粒细小、均匀的碳糊，之后将其装填到套有石墨棒的玻璃管中制成碳糊电极，电极表面要在称量纸上打磨至光滑平整。每

5、次实验前都要重新装填碳糊，以消除背景影响。1.2.2探针的固定在0.2mol/LpH=5.0醋酸盐缓冲液中，用+1.7V电压预处理电极1min；随后于含1×10-7mol/L探针（ss-DNA：A）的上述醋酸盐缓冲液中，在0.5V电压下固定探针2min，使探针固定在活化的电极表面。1.2.3电化学信号检测将电极浸入含K3Fe(CN)6指示剂（浓度为2×10-4mol/L）的0.20mol/L醋酸盐缓冲液（pH=5.0）中，用循环伏安法（CV），在-0.4—0.8V范围内，以0.01V/s的速度进行扫描，观察指示剂氧化峰电流的变化。1.2.4杂交将电极用0.75mol/LNaCl,0.02mo

6、l/L磷酸盐缓冲液淋洗，然后浸入含0.75mol/LNaCl、0.02mol/L磷酸盐缓冲液的杂交液中（其中含1×10-7mol/L的目的待测DNA分子），在0.5V电压下，进行杂交（杂交时间10～50min）。杂交后电化学信号检测同1.2.3。2结果和讨论2.1指示剂K3Fe(CN)6在ss-DNA/CPE和ds-DNA/CPE上的伏安信号首先碳糊电极经活化后其表面形成较多羧基与单链DNA中的氨基结合，将单链DNA固定在碳糊电极上，即相当于在碳糊电极上形成一层DNA膜，隔绝K3Fe(CN)6，使其电信号减弱，而后经DNA杂交，指示剂与电极接触更为困难，电信号进一步减弱，通过比较峰电流的变化

7、来判断电极表面DNA是否杂交以及杂交适度。图1指示剂在ss-DNA/CPE及ds-DNA/CPE上的不同氧化峰电流信号Fig.1Differeneoxidativepeakcurrentofindicatoronss-DNA/CPEandds-DNA/CPE曲线1、裸电极（CPE）的氧化峰电流信号；曲线2、吸附单链DNA后（ss-DNA/CPE）的氧化峰电流信号；曲线3、杂交以后双链DNA（ds-DNA/CP