植物细胞的胞吞作用和内膜系统的荧光显微观察.doc

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1、首都师范大学生物实验报告科目：细胞生物学班级：师范班姓名：王舉学号：口10800065实验名称：植物细胞的胞衿作用和内膜系统的荧光显微观察日期:10.30一、实验目的1、了解植物细胞的胞吞作用和内膜系统2、学会使用荧光显微镜二、实验原理1、植物细胞的吞排作用：细胞伸长生长所需要的物质分别在内质网（如蛋白质、脂类）和高尔基体（细胞壁的一些组分，如果胶、半纤维素）合成，运输小泡n胞吐作用分泌至胞外或质膜上，促进新的细胞膜和细胞壁的生长；另一方血，在细胞扩展增长过稈屮一些过剩的蛋白质、多糖、细胞壁前体物质等细胞成分，需要通过

2、胞吞作用重新I叫到胞质中使之得以及时回收,循环利用,即细胞的内吞和外排两个过程保持基本的相对平衡。在整个膜泡吞排作用（cytosis）中，必须有能量的保证。例如，膜泡组装形成过程屮的小G蛋白，运输过稈屮的细胞骨架及相应的马达蛋以及膜融合过程屮Rab蛋白等均发生GTP或ATP的水解反应。2、内膜系统：内膜系统是指内质网、高尔基体、囊泡、溶酶体和液泡等细胞器和质膜。这些细胞器的膜是相互流动的，处于动态平衡，在功能上也是相互协同的。3、FM类染料：是水溶性的苯乙烯类复合物，对细胞无毒性作用，使用方便。常广泛用于质膜和囊泡等的

3、备类研究常用的染料有FMl-43（Ex510/Em626）和FM4・64（Ex558/Em734）。FM类染料与质膜及内膜细胞器特异结合后发出高强度的荧光。FM4-64由一条亲脂的尾部和一个带正电荷的头部经双键相连而成的，亲脂尾部可以插入脂双层的外叶屮，而头部则阻止其进一步穿越脂双层，需要借助胞吞作用才能进入细胞内。FM4-64在水相屮没有荧光，只冇插入脂质生物膜示才显示较强的荧光，胞吞冋收的囊泡因吞进细胞内部而被荧光标记，利用这种荧光探针能够对细胞的胞吞过程进行有效标记。4、ERTracker-Blue/White的

4、作用原理：ER-TrackerBlue-WhiteSDapoxyl染料屮的一种，它的主要成分是格列本腺，是一种糖尿病患者每LI降低血糖的药物。也被用于研究胰腺B・细胞活性和胰岛素分泌和研究心肌细胞功能和心律不齐。格列木腺连接到ATP■敏感K+通道的磺魔受体，这个受体主要在ER上。5、叠氮化钠（抑制剂）：抑制细胞膜发生内吞作用。6、山梨醇（高渗液）：让细胞发生质壁分离。三、实验过程1、取3个共聚焦专用培养川L,分别编号①、②、③；2、往①屮加入198uL含BY2细胞培养液（lOOOmL移液器）和2pLFM4-64；往②中

5、加入178pL含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和20xL山梨醇;往③中加入194pL含BY2细胞培养液（lOOOmL移液器）和4pLNaN3；3、置显微镜下观察①屮的荧光分布模式；4、观察完毕①屮的FM4-64后再往①中加入4pLERBlue/white；5、往②、③中分布加入2pLFM4-64,随后先观察②中的荧光分布;6、接着再观察③屮的荧光分布模式；7、最后再次观察①中FM4-64、ER-Blue/White双染下的荧光分布。四、实验结果及分析图1：止常悬浮细胞的FM4-64标记（荧光）图2：正常悬浮细

6、胞的FM牛64标记图3：ERtrackerBlue/whitexFM4-64和GFP的图4：ERtrackerBlue/white、FM4-64和GFP的三标记（荧光）三标记图5：质壁分离的细胞的FM4-64标记（荧图6：质壁分离的细胞的FM4-64标记光）图7：吾氮化钠处理的的悬浮细胞的FM4-64图&吾氮化钠处理的的悬浮细胞的FM4-64标记（荧光）标记分析：1>正常悬浮细胞的FM4-64标记：FM4-64先标记于细胞外周，即细胞膜。其为红色荧光显示，并随着时间的延长逐渐进入细胞内部。（如图1）2、叠氮化钠处理的的

7、悬浮细胞的FM4-64标记：只有细胞外周为红色荧光，因为叠氮化钠能抑制细胞的内吞作用，使FM4-64不会进入细胞内部，这样可以进一步说明FM4-64是通过内吞作用而不是扩散进入细胞的。（如图7）3、质壁分离的细胞的FM4-64标记：用山梨醇处理细胞2・3分钟，使细胞发生质壁分离。结果显示，只有细胞膜被红色荧光标记，证明FM4-64是一种膜染料。（如图5）4、ERtrackerBlue/white>FM4-64和GFP的三标记：细胞膜显示紫红色，而一部分细胞器显示紫色（红色蓝色叠加）表明内吞的FM染料部分进入内质网等细胞

8、结构。（如图3）总之，我们先通过正常悬浮细胞的FM4-64标记，得出染料可以与细胞外周某个结构结合成红色荧光反应；我们再用质壁分离的细胞染色，得出是细胞膜被染成了红色。接着，我们川吾氮化钠抑制细胞内吞作川，结果细胞内并没冇H他结构被染色，证明了FM4-64染色是不能通过扩散等方式进入细胞内的。最麻，我们运用了三标记法重新观察了过了