采用X射线衍射解析人鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子（RalGDS）Ras结合结构域的空间结构.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第6期2015年6月ChineseJournalofAnalyticalChemistry893—898DOI：10．11895／j．issn．0253~820．150102采用X射线衍射解析人鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)Ras结合结构域的空间结构黄雪英雷明沈阳张巍刘艳丽刘珂赵浩斌。祁超(华中师范大学化学学院，武汉430079)(华中师范大学生命科学学院湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室，武汉430079)(多伦多大学结构生物学中心，加拿大M5G1L7)摘要Ra

2、s结合结构域(RBD)是鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)家族成员D端的高保守区，通过它连接Ras和Ras相关蛋白。利用RedWings和SGC-1screens相关的悬滴法设盘结晶，按体积比1：1加蛋白液到含1：100胞内蛋白酶Glu—C(w／w)的结晶溶液(2mol／L(NH4)2SO4，0．2mol／LNaAc，0．1mol／LHEPES，5％MPD，pH7．5)中，晶体3天长成可组装大小。利用x．射线晶体衍射技术解析了人RMGDS的Ras结合域(RMGDS—RBD)的晶体结构，对比鼠和人RalGDS—RBD，主

3、要是Ras结合区的C-端不同。人RalGDS-RBD通过Glu和Glu在RalGDS和Ras蛋白间形成氢键，而在同一位点，鼠RMGDS-RBD通过Asp820和Asp82：形成氢键。人RalGDS—RBD结构中含届B一型三维结构的泛素样构象，一个单体的C一端残基与相邻单体的折叠形成平行结构。关键词鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)；Ras结合结构域(RBD)；Ras蛋白1引言Ras蛋白是一类小型GTP-结合蛋白，能作为分子开关耦合细胞外信号，从而调控不同的细胞应答。细胞信号通路中，Ras蛋白表现为无活性的GDP结合形式

4、和有活性的GTP结合形式两种构象。通过两种构象之间的转换，调节细胞生长、细胞流动性及细胞增殖⋯。在GTP结合区，Ras蛋白通过与Rafs丝氨酸／苏氨酸激酶、磷脂酰肌醇3一激酶(PI3一kinase)、Ral鸟嘌呤核苷酸置换因子(Ral—GEFs)等效应分子结合，激活类似的通路。鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)家族四个成员(RalGDS、RGL、RGL2／Rlf和RGL3)含部分相同结构，均含一个带上游Ras交换锚的中央CDC25同源结构域和一个C．端Ras／Rap同源结构域(RBD)(图1A)。通过c一端RBD，Ra

5、lGDS蛋白结合Ras及Ras相关蛋白。目前，已利用核磁共振和x衍射法分析了RBDs的三维结构J。虽然RalGDS家族各成员RBDs残基没有明显的序列同源性，但它们的三维结构非常相似，各RalGDS—RBD含泛素样构象(呈型三级结构特征)，但Ras结合区和疏水核心-5]却存在结构差异。这些特点导致RalGDS．RBDs与Ras／RaplA的不同结合。从Rap和Ras效应区的突变情况来看，残基31对Ras／Rap特异性结合Raf-RBDs至关重要。。。虽然鼠和人RBDs有很高的全序列同源性和结构相似性，但与Ras蛋白结合的鼠R

6、alGDS-RBD和人RalGDS-RBD残基还是有一些不同。经最关键的Raf途径，Ras介导正常鼠细胞致瘤；经关键的Ral—GEFs途径，Ras介导正常人细胞致瘤’。鼠RalGDS．RBD的空间结构虽然早已解析，与人RalGDS—RBD的空间结构相似性较高，但还是有种属差异。以鼠RalGDS．RBD为靶标研究Ral—GDS—RBD引起的相关疾病，并根据鼠RalGDS．RBD的空间结构及作用机制为人设计药物就会有较大误差。因此，为更好地了解人RalGDS-RBD特异性结合Ras蛋白的结构基础，本研究制备了人RalGDS．RB

7、D蛋白晶体，并分析Ras结合残基及各RBDs三维结构的特点，特别是人和鼠RalGDS．RBD的差异，为下一步研究由于人和鼠RalGDS-RBD的空间结构的差异导致细胞功能的差异奠定基础，同时也可以为根据人RalGDS-RBD的空间结构及作用机制设计药物提供重要参考。2015-01．29收稿；2015-O3—17接受本文系国家自然科学基金(Nos．20772040，31300629)、教育部中央高校自主项目(No．CCNU14F01006)资助E-mml：qichao@mail．ccnu．edu．en894分析化学第43卷2实

8、验部分2．1仪器与试剂UP200S超声破碎仪(德国Hielscher公司)；Ni—NTA亲和柱和MiniPROTEAN3电泳仪(Poly．Prep，Bio—Rad公司)；Superdex-7526／60凝胶过滤柱和AKTAPurifier100ProteinPuricationSystem