高通量测序技术平台流程与应用.ppt

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1、IlluminaGenomeAnalyzer系统应用方向DNAFragment文库测序DNAMate-pair文库测序SmallRNA测序数字化表达谱测序转录组测序DNA甲基化测序ChIP-seqMeta-GenomicsDNA测序血浆微量DNA测序基因组DNA的随机打断↓DNA片段的末端修复↓将‘A’碱基加入到DNA片段的3′末端↓在DNA片段的末端加上特定接头↓PCR扩增连上接头的DNA片段↓文库检测↓DNA在ClusterStation的成簇扩增↓Illumina GenomeAnalyzer上的测序↓生物信息组装/分析IlluminaDNAFrag

2、ment文库测序流程IlluminaMate-pair文库测序流程基因组DNA随机打断特定大小片段（2-10kb范围可选）↓末端修复↓生物素标记↓环化↓获得来自大片段两端共计400-600bp的DNA片段↓修饰、加接头↓PCR扩增连上接头的DNA片段↓文库检测↓DNA在ClusterStation上的成簇扩增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的测序↓生物信息组装/分析IlluminaSmallRNA测序流程从总RNA中分离smallRNA↓5′接头连接和纯化↓3′接头连接纯化↓RT-PCR扩增↓SmallRNA文库的纯化↓文库的检测↓DNA在

3、ClusterStation成簇扩增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的测序↓生物信息学分析Illumina数字化表达谱测序流程mRNA的分离和cDNA第一链的合成↓cDNA第二链的合成↓限制性内切酶NlaIII的酶切↓连接GEXNlaIIIAdapter1↓限制性内切酶MmeI的酶切↓连接GEXAdapter2↓Adapter连接cDNA产物和PCR富集↓文库的检测↓DNA在ClusterStation上的成簇扩增↓Illumina GenomeAnalyzer上的测序↓生物信息学分析TotalRNA的DNaseI酶消化↓mRNA分离和随机

4、打断↓cDNA第一链和第二链的合成↓DNA片段的末端修复↓将“A”碱基加入到DNA片段的3′末端↓在DNA片段的末端加上特定接头↓PCR扩增连上接头的DNA片段↓文库的检测↓DNA在ClusterStation上的成簇扩增↓Illumina GenomeAnalyzer上的测序↓生物信息学分析Illumina转录组测序流程基因组DNA随机打断↓DNA片段的末端修复↓将‘A’碱基加入到DNA片段的3’末端↓DNA片段末端加上特别处理的甲基化接头↓重亚硫酸盐处理↓去盐处理↓PCR扩增连上接头的DNA片段↓文库检测↓DNA在ClusterStation上的成簇扩

5、增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的测序↓生物信息学分析IlluminaDNA甲基化测序流程染色质免疫共沉淀↓目的DNA片段↓DNA片段的末端修复↓将‘A’碱基加入到DNA片段的3‘末端↓DNA片段末端加上接头↓PCR扩增加上接头的DNA片段↓文库检测↓DNA在ClusterStation成簇扩增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的测序↓生物信息学分析IlluminaChIP-seq测序流程Meta基因组的提取↓DNA随机打断↓DNA片段末端修复↓将‘A’碱基加入到DNA片段的3′末端↓在DNA片段的末端加上接头↓纯化连接产物

6、↓PCR扩增连上接头的DNA片段↓文库的检测↓DNA在ClusterStation的成簇扩增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的测序↓生物信息组装/分析IlluminaMeta-GenomicsDNA测序流程收集10-15ml孕妇外周血↓提取血浆中游离DNA↓Q-PCR定量总DNA含量↓构建DNA文库↓Agilent和Q-PCR检测文库浓度↓Cluster制备和GenomeAnalyzer上的测序↓Pipeline和Eland分析↓计算每条染色体的Z-score值Illumina血浆微量DNA测序流程知识回顾KnowledgeReview