SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白.ppt

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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白实验六实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理；掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的操作技术（基础性很强，使用范围广泛）；学习蛋白质的考马斯亮蓝染色鉴定。YoursitehereLOGO实验原理聚丙烯酰胺凝胶:是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAG

2、E)。AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行。YoursitehereLOGO实验原理OOOCH2=CH—C—NH2+CH2=CH—C—NH—CH2—NH—C—CH=CH2(Acr)(Bis)（聚丙烯酰胺）YoursitehereLOGO实验原理YoursitehereLOGO聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用；样品用量少，灵敏度可达10-6g;凝胶孔径可调节；分辨率

3、高。YoursitehereLOGOSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）；蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。YoursitehereLOGO由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了原蛋白质分子的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒

4、。因此在进行电泳时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此，可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。YoursitehereLOGO凝胶系统的分类连续性凝胶电泳不连续凝胶电泳连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。YoursitehereLOGO实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

5、的三种效应浓缩效应电荷效应分子筛效应YoursitehereLOGO浓缩效应不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组成:浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HC1;分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8的Tris-HC1;电极缓冲液是pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。YoursitehereLOGO浓缩效应-1（凝胶孔径的不连续性）浓缩胶的凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离

6、胶之间而被浓缩至一个狭窄的区带，大大提高了电泳的灵敏度。YoursitehereLOGO在pH6.8的凝胶缓冲体系中：前导离子或快离子：HCl(解离）→Cl－，Cl－泳动速度最快;尾随离子(trailingion)或慢离子：CH2(NH2)COOH→CH2(NH2)COO－，泳动速度最慢;蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间；电泳时，Cl－超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P压缩成层；mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯离子，P代表蛋

7、白质，G代表甘氨酸根离子)，有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度。当进入pH8.8的分离胶时甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质时，不再形成高电压。浓缩效应-2（缓冲体系离子成分及pH值的不连续性）YoursitehereLOGO实验原理考马斯亮蓝是一种染料，和蛋白质结合呈蓝色。G250用来测定蛋白质含量；R250用来对电泳条带染色。YoursitehereLOGOSDS-PAGEYoursitehereLOGO实验方法分离胶的制备浓缩胶的制备加样待分离样品的准备电泳染色脱色Yoursi

8、tehereLOGO分离胶的制备置小烧杯中,混匀,迅速用移液器滴入二块玻璃板之间(短玻璃朝外),凝胶加至横板的2/3；用滴管加少许水，在室温中聚合20-30分钟。注意：acr/bis有神经毒/制胶时避免产生气泡H2O1.756ml30%丙烯酰胺溶液1.333mlPH8.8Tris-HCl（含SDS）1.875ml50%TEMED溶液3μl10%APS33.33μlYoursitehereLOGO浓缩胶的制备蒸馏水1.440ml30%丙烯酰胺溶液266μlPH6.8Tris-HCl（含SDS）27