综合性实验 蛋白质的分离提取、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳及westen印迹

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1、蛋白质的分离提取、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western印迹蛋白质的分离提取蛋白质分子在水溶液中因其表面带有一定数量的电荷及形成水化膜使其成为稳定的胶体颗粒。在某些物理或化学因素影响下，蛋白质颗粒由于失去电荷和水化膜而沉淀。中性盐、重金属盐、三氯乙酸和乙醇等都是常用的沉淀蛋白质的试剂。Ⅰ、蛋白质的盐析大量中性盐类如硫酸铵(NH4)2SO4、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使

2、各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白便沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。Ⅱ、重金属盐和三氯乙酸沉淀蛋白质重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+等可与蛋白质分子上的羧基结合生成不溶性蛋白质金属盐而沉淀。三氯乙酸属生物碱试剂，能与蛋白质分子上的氨基结合而沉淀。它们均可引起蛋白质分子的变性和失去生物学活性。PrNH3+C

3、OO-OH-PrNH2COO-Ag+PrNH2COOAgPrNH3+COO-CCl3COOHPrNH3+·-OOCCCl3COOHⅢ、乙醇沉淀蛋白质某些可与水混合的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮等，能破坏蛋白质的水化膜，降低其在溶液中的稳定性。当加入少量中性盐如NaCl等或溶液pH接近等电点时，蛋白质胶粒上的电荷被中和，加入上述有机溶剂可使蛋白质沉淀。反应在0℃～4℃下进行，并应立即分离沉淀物，否则蛋白质会变性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量一目的与要求1.学习电泳原理和技术2.学习和掌握SDS－

4、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术蛋白质是两性电解质，可带正电荷也可带负电荷。带电荷的蛋白质分子在电场中向相反的电极移动，称为电泳。血清中各种蛋白质在PH8.6的缓冲液中都带负电荷，在电场中向正极移动。移动的速度主要决定于带电荷的多少和分子的大小。电荷多、分子小，移动就快；反之就慢。因此，利用电泳时各种蛋白质分子移动的速度不同，可将血清蛋白质分成白蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白等几条区带。二实验原理离子型去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）可与蛋白质相作用，破坏蛋白质分子的非共价键，使蛋白质变性，失去原有的空

5、间构象，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，使各种蛋白质分子相互间只保持着分子大小的差异，彼此间原有的电荷差异被消除或大大降低。当SDS被引入聚丙烯酰胺凝胶系统并进行电泳时，样品中蛋白持原有的电荷差异已不起作用，蛋白质分子在电场中的迁移速度仅仅取决人于各自分子的大小。将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对其分子量的对数作图时，可得到一条标准曲线。此时，将未知分子量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，就可根据此蛋白质的电泳迁移率，在标准曲线上查得它的分子量。电泳技术分类几种常见电泳的比较类型优点缺点纸电泳设备操

6、作简单分辨率差，电渗现象醋酸纤维薄膜电泳设备操作简单，样品用量少分辨率差琼脂糖凝胶电泳快速，分辨率高电渗现象严重聚丙烯酰胺凝胶电泳可调节凝胶孔径，样品用量少分辨率高，无电渗现象高浓度凝胶难剥离聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节

7、，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-105×1052-5核酸(RNA)10415–20104–1055-10105-2×1062-

8、2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3图2夹心垂直板电泳槽示意图图3凝胶模示意图返回不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲