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1、无菌操作基本技术1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时
2、放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45。角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌而。1.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于來自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少ClassII）o
3、操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品,例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。2.定期检测下列项目：2.1.C02钢瓶之C02压力2.2.C02培养箱之C02浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。2.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）o3.水槽可添加消毒剂（Zephrin1:750）,定期更换水槽的水。实验用品3.3.5.种类：4.1.5.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻
4、璃容器与pasteurpipet夕卜,其它均为塑料无菌制品。4.1.5.TC级培养盘表而均有coating高分子物质以让细胞吸附/培养容器种类有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等，依实验需耍使用。4.1.5.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml4.1.5.塑料离心管：15ml,50ml,均有2种不同材质，其中polypropylene（PP）为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。
5、4.1.5.glasspastuerpipet:9inch,用以抽掉废弃培养液等。7.3.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml3.3.6.清洗：4.1.6.新购玻璃血清瓶先以0.1-0.05NHCI浸泡数小时，洗净后才开始使用。4.1.6.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。3.3.7.灭菌：4.1.7.实骑用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121oC,15lb,20分钟，置于ov
6、en中烘干。4.1.7.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170oC,4小时。4.1.7.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121oC,15lb,20分钟。培养基1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽中温热。2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamineo3.粉末培养基配制(以1升为例)：3.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之
7、配制体积为900ml,pH为7.2-7.4oNaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用C02气体调整pH,而非用强酸(HCI)或强碱(NaOH),因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。3.材料：3.2.纯水(milli-Q水或二次至三次蒸憎水，水品质非常重要)3.2.粉末培养基3.2.NaHCO3(SigmaS-4019)3.2A电磁搅拌器2...无菌血清瓶3...0.1或0.
8、2mm无菌过滤膜4...pHmeter5...真空帮浦6...C02气体1.步骤：1.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。1.1.称取适量之NaHCO3粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3・5分钟。1.1.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之p
