水溶性荧光聚合物纳米粒的制备及双光子成像.pdf

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1、第42卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2014年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry648—653DOI：10．3724／SP．J．1096．2014．31109水溶性荧光聚合物纳米粒的制备及双光子成像梁淑彩陈小慧刘衍斌秦蒙鄢国平(武汉大学药学院，武汉430072)(武汉工程大学材料科学与工程学院，武汉430074)摘要报道了一种能用于活细胞双光子荧光(TPF)成像的水溶性聚合物纳米粒。首先以含双羧基的萘酰亚胺作为交联剂和荧光标记试剂，通过对聚乙烯亚胺发生交联反应制备纳米粒子，然后对其结构形态、单双光子荧光性能

2、及细胞毒性进行测试。结果表明，获得的纳米粒为球形，粒径为5～10nm；以443或800am为激发波长，荧光发射波长均为536nm；在pH4．0～9．0范围内，其荧光无明显变化；在pH7．4的溶液中和激发光为443am的条件下，对其连续测定1．2万次后荧光强度变化不超过1％，说明其酸碱稳定性和光稳定性较好；浓度在15mg／L以下及与细胞作用时间在24h以内细胞毒性较低。最后，用双光子共聚焦荧光显微镜观察了其在Hela细胞中的TPF成像性能。将Hela细胞与纳米粒共同孵育2h后，在800nm激光激发下，在细胞中可观察到其绿色荧光。此纳米粒可望用于靶向性双光子荧光成像探针

3、的开发。关键词萘酰亚胺；聚乙烯亚胺；荧光聚合物纳米粒；双光子成像1引言双光子荧光(TPF)成像技术具有高的系统分辨率和信噪比，能对处在自然状态的样品进行无损观察与成像，在生物医学分析领域具有极大的应用空间。TPF成像应用的发展离不开性能优良的TPF材料。目前，有机小分子染料作为TPF材料的研究较多l1．2J，但这些材料大多光稳定性和水溶性差，在体内清除较快，不利于生物体系的成像研究。采用纳米材料可以有效减少上述问题，最具有代表性的是无机发光量子点(QD)。QD的光稳定性和荧光性能俱佳，是荧光成像领域研究的热点'4，在细胞及组织中的TPF成像应用已有报道5j。但其对人

4、体健康与生态环境可能产生的不利影响限制了其大规模生产和应用，。负载荧光染料的聚合物纳米材料具有好的生物相容性，并将大量染料包裹在一个纳米粒中，可大大提高检测灵敏度和材料的光稳定性，在单光子荧光成像方面已有广泛应用。近年来，聚合物TPF材料的开发也开始引起注意，目前报道的多以疏水性聚合物包裹1]PF染料形成聚合物纳米粒。这种纳米粒中TPF染料以非共价键方式存在，容易造成染料泄漏，同时得到的纳米材料亲水性差，使用时需分散至水溶液中或表面再进行亲水性修饰“。聚乙烯亚胺(PEI)有良好的水溶性和生物相容性，是药物传递系统常用的载体材料¨。萘酰亚胺衍生物具有好的荧光性能，如光

5、稳定性，大的Stocks位移和高的荧光强度等，已用于开发测定F一、H：S及HO，等的TPF探针¨。。本实验以含双羧基的萘酰亚胺染料对PEI进行交联制备了一种染料与聚合物共价键合的水溶性荧光聚合物纳米材料，对其结构、荧光性质及细胞毒性进行了测试，并考察了其在Hela细胞中的TPF成像。研究表明，此纳米粒为球形，粒径5～10nm；具有好的pH和光稳定性，且浓度在15mg／L以下有较低的毒性；能够进入细胞，在800am的激发光下，用共聚焦显微镜可以观察到细胞内纳米粒的绿色荧光，可望用于靶向性TPF成像探针的开发。2实验部分2．1仪器及试剂INOVA400型核磁共振仪(美国

6、Varian公司)；20DXB型红外光谱仪(美国Nicolet公司)；UV一25502013—11．14收稿；2014-01-12接受本文系国家自然科学基金(Nos．20905059，20835004)资助E—mail：chirolab@gmail．com；guopyan2006@163．com第5期梁淑彩等：水溶性荧光聚合物纳米粒的制备及双光子成像649型紫外分光光度计(日本岛津公司)；320一S型pH计(瑞士MettlerToledo公司)；LS55型荧光分光光度计(美国PerkinElmer公司)；JEM一100CXII型透射电镜(日本电子株式会社)。双光子荧

7、光光谱采用锁模飞秒钛蓝宝石激光器(美国Coherent公司)为激发源；细胞的TPF成像用LSM710型双光子共聚焦激光显微镜(德国Zeiss公司)观察。4．溴一1，8一萘酐(I>98．0％，鞍山市惠丰化工有限责任公司)；PEI(平均分子量10000Da，阿拉丁试剂有限公司)；3一(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5一二苯基四氮唑溴盐(MTr，Sigma公司)，使用前用PBS配成5g／L的溶液；高糖DMEM培养基、胎牛血清及胰蛋白酶消化液(Hyclone公司)。其它试剂均为市售分析纯；实验用水均为超纯水。2．2荧光聚合物纳米粒(PTCN)的制备及表征2．2．1PTC