毛细管电泳法在酶抑制剂筛选中的应用.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)评述与进展第5期2015年5月ChineseJournalofAnMytic~Chemistry775～782DOI：10．11895／j．issn．0253~820．141081毛细管电泳法在酶抑制剂筛选中的应用刘冬梅师彦平陈娟(中国科学院兰州化学物理研究所，中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室，兰州730000)(中国科学院大学，北京100039)摘要毛细管电泳法以其分离效率高、耗时短、样品用量少、灵敏度高以及易于实现自动

2、化等诸多特点，在筛选酶抑制剂研究中有着不可替代的优势。本文综述了毛细管电泳法在酶抑制剂筛选中的应用。主要介绍了应用最广泛的离线分析(Of-lineassay)和在线分析(In-lineassay)，即柱前酶反应(Pre-capillaryenzymereac-tion)和在柱酶分析(In．capillaryenzymereaction)。并对该领域的未来发展进行了展望。关键词毛细管电泳；酶抑制剂；柱前酶反应；在柱酶反应；综述1引言人类疾病的产生往往与体内各种酶的异常表达有关，如果酶的活性异常高于正

3、常水平，则会引起机体功能紊乱，引发疾病的产生。如乙酰胆碱酯酶(AChE)过多，则会过度分解神经递质乙酰胆碱，从而引起阿尔茨海默症(老年痴呆症)和肌无力_l；酪氨酸酶(TRS)是黑色素合成的关键酶和限速酶，TRS活性过高则会引起黑色素沉积。引发皮肤色素性疾病[2]。通过抑制关键酶来干预治疗已经成为现代医学很有吸引力的战略，目前有相当一部分临床药物来自酶抑制剂_3]。酶抑制剂筛选的传统途径有放射性同位素法、薄层色谱法、电化学法、分光光度法和高效液相色谱法等，这些方法虽然已经非常成熟，但是仍然存在一些不

4、可避免的缺陷[4]。毛细管电泳法以其分离效率高、耗时短、样品用量少、易于实现自动化等诸多特点，特别是高效分离机制，在酶抑制剂筛选中显示出传统方法无法比拟的优势。而且，毛细管电泳法可以结合多种检测方法，如紫外、激光诱导荧光、质谱、电化学以及辐射检测[5等进行目标物的分析，其中，紫外检测以其成本低、操作方便、环境友好等优势成为最广泛使用的检测方法。毛细管电泳．紫外检测的灵敏度受到待分析物浓度的限制。通过增加检测光程或样品浓缩富集可提高检测灵敏度[6]，例如改变检测池的几何形状，包括泡形池、z形池和多次

5、反射池来增加检测光程，以及零电压效应、样品堆积、场放大堆积和场放大进样等浓缩富集技术提高检测的灵敏度。Iqbal等[7]在监测核苷酸焦磷酸酶和磷酸二酯酶的反应时。在内壁涂层为聚凝胺阳离子的毛细管内，将聚凝胺加到缓冲溶液中，利用产物与聚凝胺电迁移方向相反，使得产物堆积来提高检测灵敏度。也可以通过将样品溶解在水中，或者采用稀释的缓冲液使样品堆积[8]。毛细管电泳法筛选酶抑制剂主要有4种形式：柱前酶反应(Pre．capillaryenzymereaction)、毛细管进样端反应(At．inletreac

6、tion)、电泳中介微分析(EMMA)、层流剖面的横向扩散(TDLFP)技术，其中，At．inlet、EMMA和TDLFP都属于在柱酶反应(In．capillaryenzymereaction)。下面将对这几种形式进行总结论述。2柱前酶反应离线分析(Off-lineassay)就是反应物首先在毛细管之外混合，加入底物、酶或辅酶引发反应，经特定时间的孵育之后采取适当的方法猝灭酶促反应，然后将样品注人毛细管电泳中进行分离检测，通过测2014．12-15收稿；20l533接受．本文系国家自然科学基金(N

7、os．21105106，21375136)资助．·E-mml：che~uan@licp．ca8．cn776分析化学第43卷定产物或是底物的峰面积变化来进行酶促反应动力学、抑制动力学的研究以及抑制剂的筛选[9J。。。在柱前酶反应中，毛细管电泳只作为分离系统使用。辛志宏等[11]利用毛细管离线分析测定了血管紧张素转化酶抑制剂Captopril的活性，优化了反应、分离条件，可以准确、简便、快速的分析Captopril的抑制活性，并且为进一步筛选血管紧张素转化酶抑制剂提供了筛选模型。栗娜等[1]利用毛细管

8、电泳法测定了鸡肝二氢叶酸还原酶的活力，测定已知抑制剂的半数抑制浓度，与文献数值相比较，证明该体系可用于二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选。贾蕊等1使用柱前酶反应与EMMA进行了二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选，比较两种反应模式所得实验结果，发现柱前反应模式检测灵敏度高，迁移时间和峰面积重现性好，并且易于控制。种蕾等[1]由可口革囊星虫粗提物中筛选出7种对神经氨酸酶有抑制活性的粗提物，实验中优化了反应和分离分析条件，建立的模型可用于复杂体系中抗流感病毒药物神经氨酸酶抑制剂的筛选。Iqbal等[1]