分子诊断学-—9分子诊断技术的其他临床应用.pdf

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1、分子诊断技术的其他临床应用广州医科大学附属第三医院妇产科研究所实验部黎青2017-3-24第一节分子诊断技术在移植配型中的应用•器官移植（transplantation）是指应用自体或异体的正常细胞、组织、器官，置换发生病变的或功能缺损的细胞、组织、器官，以维持与重建机体的生理功能。•目前应用较多的是实体器官移植和骨髓、造血干细胞移植等。案例分析患者张某李某性别女男年龄52岁25岁病史手术前均为经透析治疗且身体状况良好的尿毒症病人供肾来源尸肾母亲HLA配型四点相合，两点错配，术前组织配型HLA配型不符，血型一致血型一致移植✔✔2周出现移植区胀痛、少尿，血

2、液中尿素氮升高、补体水平下术后植入肾功能良好，没有出现术后表现降、血小板减少，经医生给予类似张某的情况适当的免疫抑制剂治疗后缓解因多次发生上述移植排斥反应一年后状况植入肾功能正常，身体状况良好导致肾功能完全丧失而死亡一、移植配型的基本原理•移植配型就是指在器官移植进行之前对供受者抗原的相容性进行检测，又称组织配型。•凡是由供、受者之间的等位基因差异而形成的多态性产物，均有可能作为组织相容性抗原，诱导机体产生免疫应答以清除“外来”的移植器官，引起移植排斥反应。•排斥反应的强弱关键取决于供、受者间组织相容性抗原的差异程度，差异越小，排斥反应越弱，移植的成功率

3、越高。能引起移植排斥反应的抗原主要有•人类白细胞分化抗原（humanleukocyteantigen,HLA）即人类主要组织相容性抗原（majorhistocompatibilitycomplex,MHC）•次要组织相容性抗原•血型抗原•组织特异性抗原。•HLA位于人第6号染色体短臂p21.31和32区之间，长约4000kb，根据编码分子的功能和分布的不同，可将整个复合体的基因分成三类HLAI类、II类和III类3个区。•与移植排斥反应有关的经典HLA基因位于HLA复合体的HLAI类区和HLAII类区内。•HLAI类基因包含A、B、C等座位。•HLAII

4、类基因包含DR、DP和DQ三个经典HLAII类基因。•I类抗原主要影响受者长期存活率，尤以HLA-B抗原最重要，•II类抗原对受者的长期和短期存活率均有重大影响，以HLA-DR抗原最重要。•HLA配型与移植效果最为密切的是骨髓移植，因移植物中存在大量的淋巴免疫细胞可识别宿主抗原，进而攻击宿主靶组织产生移植物抗宿主反应（graftversushostreaction,GVHR），且GVHR不易被免疫抑制剂所控制，故对HLA配型的要求非常高。•目前国际上通用的器官移植配型标准是HLA-A、B和DR六抗原无错配标准。•最佳的HLA配型为HLA-A、B和DR六抗

5、原分型全相合。A02A24A02A24A02A11B45B75B60B75B13B60DR04DR14DR04DR12DR04DR12受体1受体2供体A02A11A02A24A02A11B13B75B60B75B13B60DR04DR14DR04DR12DR04DR12受体1受体2供体二、移植配型技术•HLA分型技术先后经历了血清学、细胞学分型和基因分型阶段。•传统的HLA分型技术中以微量淋巴细胞毒实验方法为代表，由于其操作简便快捷、于1970年被美国国立卫生研究院（NIH）确立为国际通用标准技术。•进入90年代，随着分子生物学技术的迅速发展与成熟，建立

6、在DNA分子水平上的HLA基因分型技术，逐步取代传统分型技术成为HLA的主要分型方法。•1999年起美国骨髓捐赠组织（NMDP）以及世界骨髓供者协会（WMDA）都明确规定必须用DNA方法对骨髓供者进行HLA分型，自此HLA血清分型方法已完全退出历史舞台被基因分型方法取代。（一）常用的HLA基因分型技术1.PCR-RFLP分型技术原理：依据HLA基因序列在不同部位存在多个不同的酶切位点。实验操作步骤：1.DNA提取2.根据HLA基因序列设计特异性引物3.PCR扩增出包含多态性序列的目的DNA4.选择可以识别HLA基因多态性序列的限制性内切核酸酶5.通过内切

7、核酸酶消化切割相应多态性位点的PCR产物6.经凝胶电泳形成酶切图谱的差异进行检测分型2．PCR-SSO技术（PCR-sequencespecificoligonucleotideprobe,PCR-SSO）原理：应用位点或组间特异引物对HLA的多态区域进行PCR扩增，扩增过程中对产物进行放射性同位素或非放射性标记，根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针并将其固定在膜上，PCR产物与膜上探针进行特异性杂交反应，最后通过放射自显影、显色或化学发光的信号进行结果判断。如果探针与产物DNA结合则结果阳性，反之，探针在洗膜中被洗脱，结果阴性。3.PCR-SSCP技术

8、（PCR-single-strandconformationpolymorphi