猪OX2R基因分子克隆及其配体对cAMP信号通路的影响.pdf

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1、蔺帅：猪OX2R基因的分子克隆及其配体对cAMP信号通路的影响猪OX2R基因分子克隆及其配体对cAMP信号通路的影响门●·^·o^UenecloningotplgOreXln一：zreceptoranditsligandsaffectcAMPsignalingpathways研究生：蔺帅专业：基础兽医学导师：王志强副教授扬州大学兽医学院2014年6月蔺帅：猪OX2R基因的分子克隆及其配体对cAMP信号通路的影响猪OX2R基因的分子克隆及其配体对cAMP信号通路的影响研究生：蔺帅导师：王志强副教授专业：兽医药理与毒理学(扬州大学兽医学院，扬州225009)中文摘要

2、食欲肽(Orexin)是一个能够在大脑不同区域高效表达的重要神经肽，而且是一个能调节能量动态平衡的重要信号分子，食欲肽是通过相应受体即食欲肽受体(OXlR和OX2R)发挥作用的，其被发现与动物的摄食、体重、醒觉循环、能量平衡、神经功能、心血管功能调节和疼痛有关。信号分子与细胞表面的食欲肽受体2结合，即可以通过Gq蛋白介导，激活磷脂酶C13(PLCl3)，以三磷酸肌醇(IP3)为第二信使的信号通路，又能够通过Gs或Gi蛋白介导，激活腺苷酸环化酶(AC)，以环磷酸腺苷(cAMP)为第二信使的信号通路。为了揭示OX2R在猪的生长及能量调控中所起的作用，本研究通过对猪O

3、X2R基因进行分子克隆以及真核表达载体的构建，获得pcDNA3．1(+)-myc／pOXzR重组质粒后，与3xPGL4．29[1uc2p／CRE／Hygro]质粒共转染HEK293T细胞，用不同配体作用于细胞后，然后用微孔板检测仪检测荧光素酶的表达量。主要研究结果如下：l、采用RT-PCR技术从猪的下丘脑中扩增到大小为1332bp的OX2R目的基因。将猪OX2R基因片段连接到pcDNA3．1(+)真核表达载体并获重组质粒pcDNA3．1(+)一myc／pOX2R。2、将pcDNA3．1(+)-myc／pOX2R质粒以脂质体法转染HEK293T细胞，用Westem

4、blot检测OX2R在HEK293T细胞的表达，结果显示猪OX2R蛋白成功表达。3、将pcDNA3．1(+)-myc／pOX2R质粒和PGL4．29[1uc2p／CRE／Hygro]报告基因质粒按l：5的比例共转染HEK293T细胞。104M(高)、10’7M(中)和10’10M(低)三个不同浓度的TCS分别与一系列不同浓度的激动剂食欲肽A或食欲肽B作用于共同表达OX2R和荧光素酶的HEK293T细胞，通过检测荧光素酶的表达数量，间接评估各配体与受体结合后对细胞内cAMP信号通路的影响。结果发现，配体在一定浓度的范围内，细胞内cAMP水扬州大学硕士学位论文平与各

5、配体的浓度呈良好的剂量效应关系。关键词：猪；食欲肽受体2；环磷酸腺苷；报告基因蔺帅：猪OX2R基因的分子克隆及其配体对cAMP信号通路的影响一IIIGenecloningofpigorexin--2receptoranditsligandsaffectcAMPsignalingpathwaysM．S．Candidate：LINShuaiSupervisor：WANGZhi-QiangMajor：VeterinaryPharmacologyandToxicology(CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Ya

6、ngzhou225009)ABSTRACTOrexinisaneuropeptidehighlyexpressedinmanydifferentregionsofthebrain．ThesepeptidesexerttheiractionsviatwodifferentGprotein—coupledreceptors．namelyOXlandOX2Orexinreceptors．OrexinisanimportantsignalingmoleculeCanregulateenergydynamicbalance．Theyhavebeenimplicatedin

7、feeding，energyhomeostasis，neuroendocrinefunction，cardiovascularcontrol，pain，andsleep诎ecycles．OXIRandOX2RarecoupledtoGq／11proteinsthatactivatethePLC／IP3pathway,leadingtoatransientincreaseofintracellularcalcium．TheOX2RCanalsobecoupledtoGsandGipathways，leadingtoincreaseordecreaseofintra

8、cellularcAME