《转氨基作用jx》PPT课件.ppt

《《转氨基作用jx》PPT课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验：转氨基作用——纸层析法生化教研室1Herecomesyourfooter验证肝脏内存在具有转氨基作用的酶。初步掌握纸层析的原理和方法【实验目的】2Herecomesyourfooter３.茚三酮显色原理1．转氨基作用2．层析原理【实验原理】3Herecomesyourfooter转氨基作用在转氨酶的作用下，α-氨基酸的-NH2和α-酮酸的-C=O相互转化，生成相应的α-酮酸和α－氨基酸的过程。磷酸吡哆醛【实验原理】4Herecomesyourfooter最常见转氨酶：转氨基作用GPT谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase）GOT谷草转氨

2、酶(glutamicoxaloacetictransaminade）所有转氨酶的辅酶都是维生素B6的磷酸酯---磷酸吡哆醛。【实验原理】5Herecomesyourfooter（谷丙转氨酶）（丙酮酸）（丙氨酸）转氨酶R1氨基酸R2酮酸R1酮酸R2氨基酸PLP（α-酮戊二酸）（谷氨酸）【实验原理】6Herecomesyourfooter层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。它是利用混合物中各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，在两相运动中，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程

3、而达到分离。无论哪种层析均由固定相和流动相组成。7Herecomesyourfooter用水饱和的水滤纸有机溶剂+结合水=————————————样品在固定相中的浓度（C固）样品在流动相中的浓度（C流）分配系数K固定相流动相OHOHOHOH：滤纸：有机溶剂【实验原理】8HerecomesyourfooterBO迁移率Ｒf＝——————————————A点样点到斑点中心的距离（AB）点样点到溶剂前沿的距离（AO）【实验原理】9Herecomesyourfooter迁移率Rf与分配系数K的关系KRf增加样品的移动速度减少减少减少减少C固增加增加增加Rf与K呈反比【实验原理】

4、10HerecomesyourfooterCOOHHCCH3NH2COOHHCCH2CH2COOHNH2【实验原理】谷氨酸丙氨酸KGluKAlaRfGluRfKAla><11Herecomesyourfooter茚三酮H2O茚三酮水合物氨基酸茚三酮显色反应蓝紫色化合物【实验原理】12Herecomesyourfooter1、实验器材培养皿；滤纸；匀浆器；试管；试管架；恒温水浴锅；毛细管；移液管；喷雾器；剪刀；铅笔；格尺2、实验试剂（1）0.01MpH7.4磷酸缓冲液（2）0.1M丙氨酸溶液（3）0.01Mａ-酮戊二酸溶液（4）0.1M谷氨酸溶液（5）0.5％茚三酮溶液（

5、6）水饱和的苯酚【实验仪器和试剂】13Herecomesyourfooter实验操作：1.肝匀浆制备：提供转氨酶3.纸层析4.茚三酮显色2.转氨基：丙氨酸谷氨酸【实验操作】14Herecomesyourfooter1.肝匀浆制备：提供转氨酶新鲜肝脏0.5g4.5ml0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液充分匀浆至粉红色溶液充分匀浆食指抵住底部匀浆中指、食指夹住十字柄部15Herecomesyourfooter【实验操作】16Herecomesyourfooter2.转氨基：丙氨酸谷氨酸测定管对照管肝匀浆液45℃水浴箱5分钟煮沸10分钟、冷却0.5ml0.5ml丙氨酸0.

6、5ml0.5mlα酮戊二酸0.5ml0.5mlPH7.4磷酸盐缓冲液0.5ml0.5ml45℃保温30分钟45℃保温30分钟17Herecomesyourfooter3.纸层析画线→点样→打孔→做灯芯→展层1.测定管2.丙氨酸3.对照管4.谷氨酸点样点直径<0.5cm,一般点3-5滴,前一滴干后,才可点第二滴.18Herecomesyourfooter2cm3cm灯芯制作灯芯要包实，包圆灯芯下的穗要剪细19Herecomesyourfooter打孔时,不要用油笔,孔不要太大.灯芯插入小孔时,不要突出滤纸表面.灯芯要包实,包圆;灯芯下的穗要剪细打孔时，不要用油笔，孔不要太

7、大；灯芯要包实，包圆，灯芯下的穗要剪细；灯芯插入小孔时，不要突出滤纸表面。20Herecomesyourfooter4.茚三酮显色实验结果烘干→喷液→烘干→显色21Herecomesyourfooter测量点样原点到各氨基酸层析斑点中心的距离，计算各氨基酸的Ｒf值。【实验结果】22Herecomesyourfooter【实验结果】用铅笔画出条带的边框，测出表格中的数值，计算Rf值。测定参数测定样品谷氨酸丙氨酸对照点样点到斑纹中心距离(cm)点样点到溶剂前沿距离(cm)Rf值与已知的标准的氨基酸Rf进行对比，指出条带所对应的氨基酸，并根据结