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时间:2020-03-08
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1、硕女単位论文污染湖泊宏基因组文库中谷氨酸脱幾酶基因的克隆及功能研究唐铭泽I.:\i'——一户:、?又二〇五年六月.戈迫巧.巧去品,:‘':诘灘議苟;过編繁鎮讓纖觀鐵14;.占带曲祉:杆姆嘴城:巧话石沾识扣去肚雑驗诚穩議纖鐵攀^.V与f‘^:请;皆冲也V;:祐却靖记砖皆巧.'寺’.分类号0781密缀公开UDC硕±学位论文巧染湖泊宏基因組文库中谷氨酸脱綾酶基因的克隆及功能研究唐铭泽学科专业微生物学指导教师蒋承建教授2015..论文答辩日期.05.28学位授予日期201563
2、0答辩委员会主節梁静娟教授广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文,是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加W标注和致谢的地方外,论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果,也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料一。与我同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品,知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权,目日:学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版,允许论
3、文被查阅和借阅,可W将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播,可W采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于:□保在年解密后适用授权。^跡^密。""(请在1^上相应方框内打>/)^确论文作者签名I巧W:惠終日期:如指导教师签名:日期:又?/护^皮作者联系电话:电子邮箱;污染湖泊宏基因组文库中谷氨酸脱辕酶基因的克隆及功能研究摘要-ABA氨基下酸(G)是哺乳动物的重要神经递质。Y,具有多种保健功能谷氨酸脱簇酶在催化谷氨酸脱去簇基后,可生成GABA。相对于化学合成法而言-,利用微生物技术生
4、产Y氨基了酸具有不可比拟的优越性。未培养微生物中含有大量的新基因资源,而普通的分离纯化W及纯培养技术很难将其加W利用。因此,本课题探究了通过建立宏基因組文库的办法,挖掘自然界中新的谷氨酸脱簇酶基因,这在国内外谷氨酸脱幾酶的研究中鲜有报道。GEM-3Zf+本课题利用酸性污染的环境样品构建了p为载体,()’’拉cAeWc/Kaco/zDH5a为宿主的宏基因组文库,其中总共包含1.2万个阳性enBank一克隆,容量约为50.4Mb。通过随机测序并与G数据库进行致性比对一,发现该文库中包含大量与参考序列致性较低的新基因,证明了这一方法的有效性。
5、通过活性筛选策略,最终从文库中筛选得到了两个具有明显变色反应的阳性克隆,命名为pGEMWl和PGEMW2。将这两个阳性克隆中所包含的0RF与G一一enBank数据库进行致性比对和功能鉴定,最终获得了个编a妨。该基因全长约1.4化编码码谷氨酸脱簇酶的新基因,将其命名为g,一469个53条由氨基酸组成kDa,理论等电点为5.61的,分子量约为多肤链。在氨基酸水平上,它与心?C化細itonz/w属编码的谷氨酸脱簇酶%的一具有99致性,但该基因来自于全基因组注释,并没有进行功能鉴定。I将go奶基因表达的重组蛋白经镇柱纯化后,对其酶学性质进行测定,
6、‘2+2+2+2+2+发现其最适湿度为37C,最适pH值为4.7,Sr,Co,Fe、Zn、Mg2+33+2+2+和Zn对酶促反应有明显的激活作用,A1\Fe、Mii和Cu对酶促反应。EDTA有明显的抑制作用对酶活有明显的抑制作用,说明该酶对金属离子二-具有依赖性.619m/mL,k/19.483mL/ms。。纯酶的值为0gcat&n(g)与其他来源的谷氨酸脱簇酶相比较,该酶的性质参数处于中等水平。本研究建立了一整套利用宏基因组文库技术克隆得到新的谷氨酸脱綾酶基因的方法一,对于后续研究具有定的借鉴意义。关键词:宏基因组文库技术谷氨酸脱拨
7、酶大肠巧菌表达系统功能鉴定活性筛选IIGENECLONINGANDFUNCTIONALCHARACTERIZATIONOFA以GLUTAMICACIDDECARBOXYLASE"妨FROMgCONTAMINATEDLAKEMETAGENOMEABSTRACTGammaaminoacid(GABA)is泣neurotransmiterinmammals,andithasthe扣nctio打ofin
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