PCR技术原理讲解及人的SRY基因扩增.ppt

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1、PCR技术原理及人SRY基因扩增DNA的结构DNA的复制模板：基因组DNA原料：游离的核苷酸A、G、C、T催化剂：DNA聚合酶需要的条件：活细胞内的微观环境DNA的复制体内invivo体外invitroDNA的复制PCR技术的发明KaryB.MullisCalifornianhighwayKhorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。1989年美国《Science》杂志列PCR

2、为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR技术的特点1）高度的灵敏性2）特异性3）操作简便易行4）用途广泛30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）生命科学：DNA重组、转基因生物医学工程：基因疫苗、产前诊断疾病诊断：艾滋病、禽流感法医学：血迹、精斑等痕迹DNA考古学：远古人类、猛犸DNAPCR技术的应用人的性别决定人的性别决定FatherMother22pairs+XY22pairs+XX22+X22+Y22+Xspermegg22pairs+XX22pairs+XYGirlBoy1959年生物学家发现Y染色体决定人（

3、和老鼠）的男性特征;1975年，Wachtel等提出Y染色体上有一个组织相容性抗原的基因H-Y和男性决定有关;1987年,DavidPage认为Y染色体上一个特定的基因ZFY是决定男性的基因;1988年,澳大利亚的Sinclair实验室发现袋鼠类的ZFY基因不在Y染色体上，而是在常染色体上;1990年，澳大利亚女科学家MarshallGraves和英国的Lovell-Badge两个实验室发现另外一个基因SRY。人的性别决定————————YSRY男性利用PCR技术检测SRY基因男性，有SRY——阳性结果女性，无SRY——阴性结果应用：奥运会运动员的性别鉴定犯罪现场血痕、毛发的性别鉴定

4、野生动物的性别鉴定······男女总体积25lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶反应体系移液器（pipette）枪头（tips）反应管（tube）95℃3min；94℃30s、52℃30s、72℃30s30个循环；72℃延伸5min.核酸电泳1.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液。2.放入到微波炉内加热熔化3.冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固。凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内4.向电泳

5、槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去。5.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loadingbuffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内。6.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)；根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。7.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置。