免疫组化标准操作规程(SOP).doc

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1、免疫组化标准操作规程一、实验目的：蛋白物质的定性、定位检测。二、实验原理：基于利用放射性核素和其他标记物（荧光素，酶，重金属离子等）作为示踪剂，通过免疫亲和（抗原-抗体特异性结合）和核酸杂交（碱基配对特异性连接）途径，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子的动态变化而建立的一门染色技术。三、实验准备材料：移液器（P1ml，P200，Gilson）吸头（10ul，100ul，1000ul，Axygen）6cm、10cm培养皿（corning）EP管（1.5mL）试剂：胎牛血清(10099-141Invitr

2、ogen)1mol/L的TBS缓冲液0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g3%H2O2溶液仪器：通风橱，医用微波炉；四、操作流程1）脱蜡前，应将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤30分钟。2）组织芯片置于二甲苯中浸泡15分钟；3）更换二甲苯后再浸泡15分钟；4）二甲苯：乙醇=1:1混液中浸泡10分钟；5）无水乙醇中浸泡10分钟；6）95%乙醇中浸泡10分钟；7）85%乙醇中浸泡10分钟；8）75%乙醇中浸泡10分钟；9）蒸馏水中浸泡10分钟；10）用蒸馏水

3、或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭10分钟；11）抗原修复在微波炉里高火加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，低火维持20分钟；12）自然冷却至室温后，置入蒸馏水中浸泡10分钟；13）10%血清（TBS配制）封闭30分钟；14）吸弃血清，勿洗加入对应的一抗孵育过夜；15）回收一抗，TBS洗2遍，每次5分钟；16）加入二抗，室温孵育60分钟；17）TBS洗4遍，每次5分钟；18）加入DAB染色，直到显浅黄色为止，放入蒸馏水中终止反应；19）用苏木精30秒，清水漂洗7-8遍；2

4、0）脱水封片75%乙醇中，浸置5分钟；21）85%乙醇中浸泡5分钟；22）95%乙醇中浸泡5分钟；23）无水乙醇中浸泡5分钟；24）二甲苯：乙醇=1:1混液中浸泡5分钟；25）二甲苯后再浸泡5分钟；26）更换二甲苯后再浸泡5分钟；27）取出后，滴加30ul中性树胶，用盖玻片封片28）晾干，观察结果。一、注意事项1）标记的时候使用铅笔，避免标记被有机溶剂清除2）柠檬酸钠溶液煮的时候注意火候的把握，煮开后，过几秒开小火维持3）抗体类型注意区别