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《红树林共附生菌实验方案.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、研究红树林内大型藻类共附生菌的实验方案一、红树林内大型藻类采样到湛江的红树林区（如东海大堤）采集藻类，通过分类根据实验需要再选取其屮的某一种作为实验材料。二、试验方法1、研磨匀浆法用无菌海水冲洗样品3次，去掉非附着生物，用灭菌纱布吸干藻体表面水分,用无菌剪刀剪取10g的湿样（均匀藻样）并将其剪碎，至无菌研钵屮研磨，磨碎后用90ml盐度15〜20的无菌海水少量多次的将其洗入150ml无菌三角瓶屮（瓶小含有玻璃珠）。取上清液并用试管对其进行梯度稀释，制成10"、IOSICT?稀释度的菌悬液，用灭菌移液枪吸取100UL菌悬液在平板上均匀涂布，每-•梯度重复4个板。放入2&C恒温箱培养，分别
2、于36h、48h.72h三次进行菌落计数,根据下述公式进行换算得每g鲜重海藻所得的细菌密度（BN,cells/g）:BN=V•[10xl0_,cfu+100X10~2cfu]/（6xW）其屮:BN为单位海藻重量所分离的菌落数（cells/g）,V为处理液的体积（mL）,10‘cfu、102cfu分别为10"、Id?稀释梯度平板上36h、48h、72h三次计数最多一次的菌落个数，W为海藻鲜重（g）。及吋挑取形态不同的菌落，进行纯化培养,直到没有新的菌落长出，该过程约持续1周。对于纯化培养的细菌要对其进行保存，并对其菌落进行形状、大小、颜色、革兰氏染色观察和描述，以便进行常规鉴定和分子鉴
3、定。2、研磨匀浆与旋涡振荡法联用用无菌海水冲洗样品3次，用无菌剪刀剪取10g的湿样（均匀藻样）并将其剪碎，至无菌研钵屮研磨，磨碎后用90ml盐度15〜20的无菌海水少量多次的将其洗入150ml无菌三角瓶屮（瓶屮含有玻璃珠）；将三角瓶放在旋涡振荡器丄振荡，作用吋间6分钟，稍静止。取上清液并用试管对其进行梯度稀释，制成1010103稀释度的菌悬液，用灭菌移液枪吸取100UL菌悬液在平板上均匀涂布,每一梯度重复4个板。放入2&C恒温箱培养，分别于36h、48h、72h三次进行菌落计数，根据公式换算每g鲜重海藻所得的细菌密度。及时挑取形态不同的菌落，进行纯化培养，直到没有新的菌落长出，该
4、过程约持续1周。对于纯化培养的细菌要对其进行保存，并对其菌落进行形状、大小、颜色、革兰氏染色观察和描述，以便进行常规鉴定和分子鉴定。3、研磨匀浆与超声波粉碎法联用用无菌海水冲洗样品3次，用无菌剪刀剪取10g的湿样（均匀藻样）并将其剪碎，至无菌研钵屮研磨，磨碎后用90ml盐度15~20的无菌海水少量多次的将其洗入150ml无菌三角瓶屮（瓶屮含有玻璃珠）；进行超声波粉碎，功率30W作用吋间30s,稍静止。取上清液并用试管对其进行梯度稀释，制成10"、IOSIO-?稀释度的菌悬液，用灭菌移液枪吸取100UL菌悬液在平板上均匀涂布，每-•梯度重复4个板。放入2&C恒温箱培养，分别于36h、4
5、8h、72h三次进行菌落计数，根据公式换算每莒鲜重海藻所得的细菌密度。及吋挑取形态不同的菌落，进行纯化培养，直到没有新的菌落长出，该过程约持续1周。对于纯化培养的细菌要对其进行保存，并对其菌落进行形状、大小、颜色、革兰氏染色观察和描述，以便进行常规鉴定和分子鉴定。4、研磨匀浆、超声波粉碎与旋涡振荡法联用用无菌海水冲洗样品3次，用无菌剪刀剪取l（）g的湿样（均匀藻样）并将其剪碎，至无菌研钵屮研磨，磨碎后用90ml盐度15〜20的无菌海水少量多次的将其洗入150ml无菌三角瓶屮（瓶屮含有玻璃珠）；进行超声波粉碎，功率30W作用吋间30s；再将三角瓶放在旋涡振荡器上振荡，作用时间6分钟，稍
6、静止。取上清液并用试管对其进行梯度稀释，制成10」、1010'3稀释度的菌悬液，用灭菌移液枪吸取100UL菌悬液在平板上均匀涂布，每-梯度重复4个板。放入2&C恒温箱培养，分别于36h、48h、72h三次进行菌落计数，根据公式换算每g鲜重海藻所得的细菌密度。及时挑取形态不同的菌落，进行纯化培养，直到没有新的菌落长出，该过程约持续1周。对于纯化培养的细菌要对其进行保存，并对其菌落进行形状、大小、颜色、革兰氏染色观察和描述，以便进行常规鉴定和分子鉴定。5、荧光显微计数和藻类样品的含水量及水分系数接种做完后的150ml三角瓶样品，加甲醛（卅作100%浓度）固定、保持终极浓度4%（体积比）
7、，进行荧光显微计数。另取10克左右的湿藻样，置于烘箱80°C烘至恒重，称重，计算样品的含水量和水分系数。三、所需平板培养基的配制⑴、海洋细菌培养基Zobell2216E:酵母膏2g,FeP030.05g,蛋白豚10g海水定容lOOOrnL,琼脂20g,pH8.0o（2）、海洋真菌培养基：马丁氏琼脂培养基葡萄糖10g,蛋白豚5g,KH2PO4lg,MgSO4>7H2O0.5g,孟加拉红（lmg/ml）3.3ml,琼脂20g,水1000ml,pH为口然pH。1
