HPLC流动相溶剂的选择和缓冲液的配制.doc

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1、HPLC流动相溶剂的选择和缓冲液的配制-之配制　　缓冲液的配置(最佳方法)　　1.将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液(溶液A)　　2.用pH计确定或调节溶液A的pH。　　3.将一定体积(如200mL)的有机溶剂B与由步骤2配制的溶液A(如800mL)混合，制成最终流动相(此处的有机相为20%)　　4.检查最终流动相的pH(此步骤为选项)由于测定含有有机调解剂的流动相pH计发生飘移，使其测定pH不很可靠.所以上面的步骤4一般只有在考察误差的主要来源时采用，大多数实验室皆略去此步骤。　　另外要注意上表中调节剂的浓度，不适当的浓度和波长选择，会造成基线本底吸收太高，基线不稳，影响分析。要注意溶

2、剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作洗脱的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵(pH5.16)做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。　　综述　　混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。HPLC流

3、动相溶剂的选择和缓冲液的配制-之选择　　HPLC流动相溶剂选择的一般原则：　　1.溶剂要与使用的检测器匹配对UV-Vis，主要考虑本底吸收，下面是常用溶剂在不同波长下的吸收值：200205210215220230240250　　乙腈0.050.030.020.010.01<0.01　　甲醇2.061.000.530.370.240.110.050.02　　THF2.442.572.311.801.540.940.420.21　　醋酸1%2.612.632.612.432.170.870.140.01　　磷酸0.1%<0.01　　三氟乙酸1.200.780.540.340.200.06<

4、0.01　　三乙胺1%2.332.422.502.452.371.960.500.12　　研究表明，当流动相的A>0.7的时候，基线噪声会显著增加，一般选择的吸收值<0.5。当A>1.0时，基本就不能用使了。对于示差折光检测器，主要考虑样品和流动相的折光率，这里不再赘述。　　2.选用的溶剂粘度要低、沸点适中使用低粘度溶剂，可减小容质的传质阻力，降低柱压，利于提高柱效。从分离制备和色质连用考虑，沸点要适中，低沸点的溶剂有它的优点;但仅仅用于分析，沸点太低，反而由于溶剂的挥发，造成保留时间的变化。　　3.尽量不用高毒性的溶剂不只是环境，单从我们自身的安全考虑，当然用低毒溶剂最好。　　4.溶

5、剂对样品有足够的溶解力样品如果不能溶解在选用的溶剂里，还怎么分析?不屑多解释。但如果样品在流动相里溶剂仍然不大，可以用样品的最佳溶剂先溶解，再用流动相稀释，就可以了。　　知道了上面选择溶剂的一般原则，就不难理解为什么不同乙醇、丙醇做流动相的原因了，因为它们的粘度大。　　还有丙酮，虽然粘度和毒性较低、溶解度大、极性适中，但用于它的截至吸收波长为330nm，所以不常用，如果样品的吸收大于330nm，其实用丙酮是一个不错的选择。