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1、课程论文！！！！！！！！干扰素基因工程法生产和构建(2006-04-1421:51:59)转载▼干扰素最早是由英国科学家Isaacs和LindeImam1于1957年发现的。他们在研究病毒干扰现象时,将56℃加热1h灭活的流感病毒加入到鸡胚绒毛尿囊膜碎片中,孵育后发现此膜能抵抗活流感病毒的感染,并且向外周释放具有干扰活性的因子,离心后吸取的上清液能使别的鸡胚绒毛尿囊膜碎片获得对病毒的抗性,他们将该物质称为干扰素(interferon,IFN)。此后,1965年发现了白细胞干扰素,1969年发现了致敏细胞干扰素。从此,关于干扰素的研究
2、便红红火火地展开了O一、序列结构干扰素的序列结构见图12-10第一节概述二、分类国际干扰素命名委员会1980年对干扰素下的定义为:一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质。现在,→般指脊椎动物细胞受干扰素诱生剂作用后合成的一类具有细胞功能调节作用的蛋白O人干扰素根据其来源细胞不同,分为白细胞干扰素(IFN-α)、类淋巴细胞干扰素(IFN-α与IFN币的混合物)、成纤维细胞干扰素(IFNmp)、T细胞干扰素(又称为免疫干扰素，IFN-r)等几类，其理化性质如表12-1。对上表还应说明的是IFN-α目前常用的为IFN-αIKEN-αI
3、Ia和IFN-αIIbo其中IFN-αIb由166个氨基酸组成,相对分子量约为19329,含有5个Cys,形成两个二硫键,其余一个Cys的存在使其易形成二聚体,降低活性。其等电点介于5~6之间。IFN-αHa由165个氨基酸组成,相对分子量约为19219,有4个cys,1位Cys与98位Cys、29位Cys与138位Cys之间形成两个二硫键,而后者对其活性有很重要的作用。IFN-αHa等电点介于576之间,在PH2.5时较IFN-αEa稳定,对热稳定,对蛋白酶敏感。IFN-αHb与IFN-αHa只相差一个氨基酸,即23位的Lys改为
4、Arg,性质也相仿O另外叭利用基因工程方法表达的IFN-γ与天然的IFN-γ也有所不同。未然的IFN-y由146=个氨基酸组成,相对分子量约为20000~25000。而用基因工程表达的IFN-γ为了提高活性,去除了Nm端的3个氨基酸,其相对分子量只有16675。重组IFN-γ的C端不齐,被蛋白酶在Arg、Lys处及其他氨基酸等多处水解后形成长度不同的分子,但大都保留了活性。三、生物学活性干扰素作为免疫系统抵御外源物质的一种手段,其作用有:①抑制病毒等细胞内微生物的增殖;②抗细胞增殖;③通过作用于巨噬细胞、NK细胞、T淋巴细胞、B淋巴
5、细胞而进行免疫调节;④改变细胞表面的状态,使负电荷增加,组织相容性抗原表达增加;⑤增加细胞对双链DNA的敏感性。研究表明,IFN-α可抗血中艾滋病毒、肝炎病毒,IFN-R能有效地治疗病毒引起的带状痕瘁,对乳腺癌、肾细胞癌、恶性黑色素瘤等也有一定的作用。IFN-α、IFN-O与IFN-γ合用在抗肿瘤方面的应用也在研究中O四、传统方法生产干扰素由于干扰素有高度的种属特异性,所以起初临床使用的干扰素都用人的细胞制备。α干扰素用人血白细胞或淋巴细胞制备,自干扰素用人成纤维细胞制备。但传统方法的不利之处限制了其在医疗方面的应用:①成本高O以白
6、细胞干扰素为例,芬兰Cantell实验室在1979年从45000L血中才生产了200mg干扰素,由此估计,1kg纯干扰素价值约220~440亿美元,1992年西格玛公司的标价是IFN-α182.2美元/100万U,IFN-γ213.6美元/50万U,而用IFN-α治疗一位肝炎病人需要3万美元。②组分多。一种细胞在诱生剂作用下产生的为多种干扰素的混和物。如白细胞产生的99%为α干扰素,1%为自干扰素。Namalva细胞产生的80%为α干扰素,20%为自干扰素。③纯度低,活性低。用病毒或polyI:C处理外周血白细胞、类淋巴母细胞(Na
7、malva)、成纤维母细胞,得到的均为混合物,用传统方法大量生产的干扰素的纯度最高也只有1%,活性在10000~50000U/mg,必须进行纯化、活性鉴定后才能应用。而比较一致的意见认为临床人干扰素的纯度不得低于106U/mg蛋白,如用于静脉注射,则纯度还要提高。④产品的不稳定性。不同厂家、不同批号poly(I:C)的干扰素诱生能力有很大的差别,必须有选择地使用。第二节基因工程生产干扰素1973年Cohen将两种不同的DNA分子进行体外重组,并用大肠杆菌表达,使大量、廉价制备单组分干扰素成为可能。1980年,利用基因工程成功地获得了
8、IFN-α及IFN-P的CDNA,标志着第2代干扰素的诞生,1982年又获得了IFN-γ的CDNA。用高表达质粒在大肠杆菌中进行表达,得到的每升菌液中含2.5亿U的IFN-α,相当于从100L人血中获得的提取量,尤其诱人的是用多角病毒
