生物化学实验3 蔗糖酶蛋白含量的测定.ppt

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1、实验三蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法一、实验目的和要求1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量；3、掌握分光光度计的使用方法。二、实验基本原理Folin-酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚

2、基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L.优点：简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。缺点：该反应受多种因素的干扰。1.蛋白质(肽键)OHˉ甲试剂(酒石酸钾钠铜盐)生成紫红色络合物蛋白质中的酪氨酸和色氨酸紫红色络合物OHˉ乙试剂产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）二、实验材料与试剂1、实验材料：蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。2、实验试剂：⑴标准蛋白质

3、溶液：0.5g/L牛血清白蛋白⑵Folin-酚试剂①甲试剂②乙试剂三、实验器材与仪器1、试管及试管架；2、可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿；3、恒温水浴箱(25℃）。四、实验操作方法和步骤1、制备Folin-酚法蛋白质标准曲线取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。试管号1234560.5g/L标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81蒸馏水（ml）10.80.60.40.20Folin-酚试剂甲（ml）555555混匀，在室温(25℃）下静置10min

4、Folin-酚试剂乙（ml）0.50.50.50.50.50.5混匀，在室温(25℃）下静置20minA500nm表12、各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。取13支试管，编号1～13，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。样品空白I(1:30）Ⅱ(

5、1:30）Ⅲ（1:15）Ⅳ(原液)编号12345678910111213样品液V(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.5水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5Folin－酚甲试剂(ml)5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0混匀后，室温（25℃）放置10分钟Folin－酚乙试剂(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5混匀后，室温（25℃）放

6、置20分钟A500nm0表23、绘制标准曲线并计算⑴绘制标准曲线：以光吸收值（A500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。⑵计算：蔗糖酶提取分离纯化的样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀释溶液的光吸收值（A500nm），查蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。五、实验结果与分析六、注意事项加入Folin-酚乙试剂后，要迅速混匀（加一管混匀一管），使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。