生物化学-生化实验.doc

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1、1、层析时为什么要防止局部盐浓度过高？不同蛋白质的盐析浓度不同，若局部盐浓度过高，将导致本来应该沉淀析出的蛋白未析出，而不应该析出的蛋白却沉淀析出了，在最后得到的蛋白粗制品中含有其他杂蛋白或者造成所要提取的蛋白的损失。2、分段盐析原理?由于不同蛋白质分子大小及带点状态各不相同，所以盐析所需的盐浓度不同，可以通过调节所加中性盐的浓度，使混合蛋白质浓液中的不同蛋白质分别析出，达到分离的目的。3、列举蛋白质初级纯化的其他方法？电泳法、亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、等电点沉淀法4、凝胶过滤层析和

2、凝胶电泳中的分子筛效应有何不同？为什么？凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。而在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中，蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。进入分离

3、胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。整块胶板相当于一个分子筛。5、醋酸纤维素薄膜电泳的特点？快速省时、色带分离清晰、灵敏度高，样品用量少、应用面广、便于保存6、竞争性抑制酶的特点？抑制剂的化学结构与底物相似，与底物竞争酶的活性部位，从而影响酶与底物的结合，抑制剂和酶是非共价结合，因此可以通过增大底物浓度来消除抑制，Vmas不变，Km增大。7、酶性

4、质鉴定试验的设计有什么特点？Ø坚持单一变量原则，通过控制无关变量来研究单一变量对实验的影响。Ø比较烦，通过同意实验中不同组别结果的比较来得到结论。8、在琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制观察试验中为什么反应开始后，反应液必须静止，不能再摇动？在此次试验中把甲烯蓝作为指示剂，在无氧条件下，氧化型的受氢体甲烯蓝（蓝色）接受氢成为还原型的受氢体甲烯蓝（无色），通过观察蓝色到无色的变化来了解脱氢酶的活性，实验开始前用石蜡封液面，开始后若再摇动，空气中的氧将进入，而氢在有氧条件下经过一系列反应将变成水，会影

5、响对脱氢酶活性的判断，造成实验误差。9、血浆与血清的区别？血浆：抗凝采血后立即分离，含有纤维蛋白原和前凝血酶。血清：血液凝固，血清析出后分离，不含纤维蛋白原和前凝血酶。10、聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理？聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进

6、行。带点颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的方向移动，这种现象称为电泳。11、聚丙烯酰胺凝胶电泳中何为连续体系，何为不连续体系？两者的区别是什么？连续系统：是指电泳系统采用相同孔径的凝胶、缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制胶简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进胶后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。不连续系统：是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳

7、分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。不连续体系的四个不连续：凝胶浓度的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续性。两者区别:不连续体系中包含了两种以上的缓冲液成分、PH值和凝胶孔径，电泳时形成的电位梯度也不均匀，因此具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。连续体系中缓冲液成分、PH、凝胶孔径、形成的电位梯度均相同，因此只有电荷效

8、应、分子筛效应。12、乳酸脱氢酶同工酶（LDH）活性染色原理？LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：13、碱变性提取RNA中各物质的作用?葡萄糖：将EP管上的大肠杆菌尽可能悬于溶液中；Tris-Hcl:提供适宜的PH缓冲条件；EDTA-Na：螯合溶液中的金属离子，防止核酸水解酶将核酸水解；NaOH:使染色体DNA和质粒DNA均变性；