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1、实验一 α－淀粉酶的制备一、实验目的学习并掌握α－淀粉酶的制备工艺。二、实验原理α－淀粉酶广泛存在于植物、哺乳动物和微生物中。α－淀粉酶是内切酶，酶的作用点仅限于淀粉链的α－1，4糖苷键，对α－1，6糖苷键不能作用，但能越过α－1，6糖苷键，将α－1，4糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐变红棕色。在酶解的最初阶段，α－淀粉酶对淀粉的水解速度很快，但当水解到一定程度后，水解虽在继续进行，水解速度却变得缓慢。该酶的最小作用底物是麦芽三糖以上的低聚糖，对麦芽三糖的作用很弱，
2、对麦芽糖没有水解能力。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是当今工业酶制剂的主要生产菌种之一，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。本实验利用高产α－淀粉酶的枯草芽孢杆菌T2生产α－淀粉酶用于制备淀粉水解糖。三、实验器材1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）T22.仪器：洁净工作台、灭菌锅、振荡培养箱、高速冷冻离心机、高压灭菌锅四、实验步骤1.培养基的制备与灭菌发酵培养基：蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO41g，MgSO4.7H2O
3、0.25g，CaCl2.2H2O0.1g，H2O500mL，pH7.0。分装于100mL锥形瓶中，每瓶50mL，121℃灭菌20min。2.接种与产酶培养接种环灼烧灭菌后，轻轻刮取斜面种子培养基中的少量菌体，接入液体培养基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中。37℃振荡培养48h。3.离心将发酵液置高速冷冻离心机中10000r/min离心10min，除菌体，上清液即为α－淀粉酶粗酶液。实验二 糖化酶的制备一、实验目的学习并掌握黑曲霉发酵产生糖化酶的基本原理及操作方法。二、实验原理糖
4、化酶又称葡萄糖淀粉酶(glucoamylase,EC3.2.1.3)，其作用方式不像α-淀粉酶那样无作用次序,而是从底物链的非还原性末端开始,顺次切下一个个葡萄糖单位,遇到分支处的α-1,6糖苷键时,可将α-1,6糖苷键切开,然后继续作用α-1,4糖苷键,直到产物全部成为葡萄糖为止。但糖化酶对α-1,6糖苷键的作用速度远不及对α-1,4糖苷键的作用速度，因此水解支链淀粉多的淀粉时，需延长水解作用时间或添加部分支链淀粉酶。我国糖化酶的生产主要由黑曲霉优良菌种经深层发酵精制提炼而成。本实验利用黑曲霉具有多种活
5、力较强酶系的特点，利用淀粉类物质为原料，获得制备淀粉水解糖所需的糖化酶。三、实验材料1.菌种：黑曲霉（Aspergillusniger）2.仪器：洁净工作台、灭菌锅、振荡培养箱、高速冷冻离心机、高压灭菌锅四、实验步骤实验流程：保藏菌种®菌株活化及平板扩大培养®摇瓶培养1.菌株活化及扩大培养①制备PDA培养基：去皮马铃薯200g切成小块，加水约500mL，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g，琼脂20g。溶化后加水定容至1000mL，分装于250ml锥形瓶中，121℃灭菌20min，自然pH。②
6、接种：取灭菌后PDA培养基倒平板，冷却后，接种斜面保藏的黑曲霉（Aspergillusniger）菌种，28℃恒温培养3d。2.摇瓶发酵培养①发酵培养基的制备：玉米粉培养基：玉米粉30g,米糠5g,麸皮5g,加水1000ml,拌匀至无干粉又无结团，分装于250ml锥形瓶内，每瓶100ml,自然pH，121℃灭菌20min。②接种与产酶培养:取培养72h的黑曲霉平板，用打孔器打孔制成菌片。每个锥形瓶中接种12片，28℃振荡培养96h。3.离心将摇床培养4d的黑曲霉发酵液4层纱布过滤后离心（10000r/mi
7、n，10min）除菌体，所得上清液即为糖化酶粗酶液。实验三糖化酶活力测定一、实验目的1.掌握糖化酶酶活定义及其计算方法。酶活定义：将1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。2.掌握糖化酶的测定方法及原理。二、实验原理糖化酶是一种外切型糖苷酶，可从淀粉分子的非还原性末端依次水解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖。本实验根据3，5．二硝基水杨酸(DNS)与葡萄糖共热后被还原成棕红色的3－氨基－5硝基水杨
8、酸在波长540nm处有较强光吸收且吸光度值与葡萄糖量呈正比的原理，利用分光光度计测定显色反应的吸光度值并根据吸光度值与葡萄糖含量的相互关系（见附图）确定糖化酶活力。附图：葡萄糖标准曲线三、实验材料1.仪器：恒温水浴锅、分光光度计、秒表、比色管、玻璃仪器等2.酶液：实验二所得粗酶液3.试剂（1）0.2mol/LpH4.5醋酸缓冲液：称取16.4g无水醋酸钠，溶解并定容至1000mL(A液)。取分析纯冰醋酸11.6mL定容至100
