免疫组织化学又称免疫细胞化学.doc

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1、免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。　　免疫组织化学的全过程包括：1

2、.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果。　3、免疫组织化学染色　　SP法　　1）脱蜡、水化；　　2）PBS洗2～3次各5分钟；　　3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；　　4）PBS洗2～3次各5分钟；　　5）抗原修复；　　6）PBS洗2～3次各5分钟；　　7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。　　8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静

3、置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。　　9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。　　10）PBS洗3次各5分钟；　　11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；　　12）II抗中可加入0.05%的tween-20。　　13）PBS洗3次各5分钟；　　14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；　　15）PBS或自来水冲洗10分钟；　　16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；　　17）自来水冲洗10～15分钟；　　18）脱水、透明、封片、镜检　免疫组织化学的概念：　　免疫组化是利用抗

4、原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。　　免疫组化实验所用的抗体有哪些？　　免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。　　免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？　　实

5、验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。　　石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？　　石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发

6、生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。　　常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。　　免疫组化常用的染色方法有哪些？　　根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其

7、中生物素——抗生物素染色法最常用。　　抗体交叉反应的原因：　　指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：　　1.抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。　　2.共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。　　3.决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相

8、应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。　　多抗和单抗特性比较：　　1.均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。　　2.稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。　　3.特异性。单抗是单一地针