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1、siRNAs在基因治疗中的应用(文章来源于:世界华人消化杂志)引言小干扰RNAs(smallinterferingRNAs,siRNAs)是RNA干扰(RNAinterference,RNAi)过程中的效应分子.Fireetal[1]在1998年向秀丽隐杆线虫中注射双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)分子后降解了细胞质中含有同源序列的耙mRNA.随后的研究表明,RNAi现象广泛存在于真菌、拟南芥、斑马角、果蝇、小鼠及大鼠等大多数真核生物中.早期在哺乳动物细胞中应用长dsRNA可引起非待异性干扰索反应而
2、导致细胞死亡，后来遗传学和生物化学硏究证明将dsKNA切割成21-28个核昔酸的siRNAs后不引起干扰索反应，并能有效降解含有同源序列的靶mRNA.因此，siRNAs正迅速发展成为研究基因功能的新工具和作为治疗的新手段.1siRNAs的沉默机制siRNAs是山RNase-Ill家族屮被称为Dicer的核酸内切酶在细胞质屮剪切自然存在的长dsRNA的过程屮产生的.Dicer将长dsRNA剪切为21-28个核昔酸的siRNA双链.这种siRNA双链除了在5'末端是磷酸,3'末端是瓮基外，3'端还有山2个核昔酸构成的悬突.siRN
3、A双链与诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)结合后裂解为siRNA单链，与siRNA单链完全互补结合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，从而达到基因沉默的目的.现在siRNA能够像核酶一样通过化学合成的方法或者通过载体表达双链短发夹样RNA(shorthairpin-likeRNA,shRXA)进入到细胞内，后者在细胞内可转化为siRNA而发挥基因沉默效应.一些研究证明siRNAs还有其他沉默机制,例如在几种生物中能够通过RNAi途径修饰细胞染色质导致转录水平的基因沉默[2-3]
4、.miRNAs(microRNAs)是一类菲编码小分fKNA,具有和siRNAs相似的功能，调节细胞内基因表达.成熟的miRNA是山胞质屮70个核昔酸组成的发夹样结构前体剪切为21-22个核昔酸分子组成的单链.他们组装成蛋白复合体(miRNP)后在核糖体内与mRNA3,端非翻译区部分互补结合从而阻止mRNA的翻译.如果与同源性靶mRNA完全互补结合，那么miRNAs像siRNAs—样能够通过正反馈途径循环降解靶mRNA.2siRNAs的基因沉默效率及其安全性各种基因沉默的方法是否能够高效作用于靶冃标仍然是其应用于治疗的一个关键
5、问题.Harborthetal[4]研究表明RNA结合蛋白，腻NA的二级结构和三级结构能够影响siRNA的沉默效率.绝大多数研究都证实siRNAs比各种寡脱氧核昔酸(o1igodeoxyribonuc1eicacids,ODNs)更有效,并且作用时间更长.作用于同样的靶H标siRNAs的半数最大抑制浓度(1C50)比磷硫酰修饰的ODNs低100-1000倍.尽管尚未对siRNAs与核悔和/或DNA嗨的效率进行广泛地系统性比较，但Drewetdl⑸研究表明siRNAs比核嗨和/或DNA悔更有效，且具有长发夹结构的RNA比锤头结构
6、的核酶能更强烈的抑制靶基因表达.低浓度的siRNAs就能启动基因沉默的过程，因为他们能快速、特异性与RISC结合,从而减少了与非特异性蛋白结合的可能，这有利于减少siRNAs在治疗中的非特异性反应•事实上已有研究证明转染中等浓度的siRNAs并不引起全身非特异性反应[6].也有三项研究[7-9]认为siRNAs引起的非特异性反应与siRNAs的浓度、细胞类型、转染试剂以及siRNAs的转染方式有关.这些非特异性反应包括刺激基因亚型引起的干扰索反应，但硏究并非像人们想象的那样，所产生的干扰素反应并不影响细胞生长.1siRNAs的
7、表达载体山于siRNAs既可以通过化学合成获得，也可以通过載体表达，这使具有耙向性的药物应用于基因治疗成为可能.表达siRNAs的载体通常含有RNA聚合酶III启动子(RNApolymerase111promoter,polIII)或RNA聚合酶II启动子(polII)序列,首先转录生成与miRNA前体相似的shRNA,然后在细胞内变成siRNA发挥基因沉默效应.在活体内和培养组织细胞中应用表达siRNA的载体能够长时间整合到基因组中并“敲除”内源性基因•许多研究证明腺病毒载体、腺相关病S(adeno-associatedvi
8、ral,AAV)体、逆转录病毒载体及慢病锋载体都能有效转染到活体内和培养细胞+.Shinagawaetal［10］研究表明含“1II的表达载体能在体内产生山数百个碱基对构成的shRNA,而不诱导非特异性干扰索反应，这为siRNAs应用于哺乳动物提供了一种安全的新方法.2siR
