细胞培养技术 教学课件 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 理论部分3动物细胞培养的准备工作.ppt

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1、第三章动物细胞培养的准备工作第一节培养用品的清洗、包装和消毒玻璃器皿的清洗浸泡（自来水）→刷洗（洗衣粉）→酸泡（24小时）→自来水冲洗→蒸溜水浸泡和冲洗→50℃烘干橡胶、塑料制品的清洗清水清洗→浸于自来水过夜→用纱布或棉签和50℃稀洗液刷洗→流水冲洗（15－20遍）→晾干→浸于清洁液15分钟→流水冲洗（15－20遍）→蒸馏水浸洗三次，三蒸水泡24小时→晾干或50℃烘干备用。清洗金属器械的清洗放到含洗涤剂的水中反复刷洗后→自来水反复冲洗干净→晾干→用75％酒精擦拭→自来水反复冲洗干净→最后三蒸水浸洗3次，晾干或50℃烘干备用。正压除菌滤器的清洗含稀洗涤剂的水中，反复刷洗后→流水冲洗1

2、5min→漓水→蒸馏水浸泡24h→三蒸水浸泡24h→晾干或50℃烘干备用。清洗清洗时应注意：浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。冲洗时要流水振荡冲洗，方法是：每瓶灌2/3容积的自来水，振荡后倒掉，重复15-20次。煮沸前水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂。清洗清洁液的配制配制时先在容器中加入蒸馏水，加热溶解重铬酸钾，再将容器置流动自来水中，待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边搅拌。包装时应注意：手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端；封闭器材使用端，标记器材手持端；小包装；玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端等）加棉花。包装湿热灭菌：最常用，适用对象广。干

3、热灭菌：适用于玻璃器皿。紫外线灭菌：适用于表面和空间消毒。过滤除菌：大多数的培养用液如：培养液、酶液和血清等均采用过滤除菌。消毒和灭菌第二节动物细胞培养用液平衡盐溶液（BSS）消化液培养基组成：主要是由无机盐、葡萄糖组成。种类：常用的有Hanks液、D-Hanks液和PBS。后两者为无Ca2+、Mg2+和葡萄糖的缓冲液。作用：维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。Hanks液常用于洗涤组织细胞；D-Hanks液和PBS常用于配制分离细胞的消化液。除菌方式：Hanks液因含葡萄糖（在高压下易分解）需过滤除菌。D-Hanks液和PBS可高压灭菌。平衡盐溶液作用原理：胰蛋白酶作

4、用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，从而使细胞分离。常用浓度：0.25％和0.125％。用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液或PBS液配制除菌方式：用滤器过滤除菌。含血清培养液终止其对细胞的消化作用消化液1、胰蛋白酶液2、EDTA溶液作用原理：从细胞生存环境中夺取有利于维持组织完整性的Ca2+、Mg2+。适用对象：只用于消化传代细胞；对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。常用浓度：0.02%，配制时应加碱助溶除菌方式：配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。其对细胞的消化作用不受血清抑止，故消化后应彻底除去。培养基培养基（培养液）

5、是维持体外细胞生存和生长的溶液，提供细胞生长所需的各种营养和因子，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限；成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析；易污染，保存期至多一年。因此逐渐为合成培养基所替代。合成培养基：合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如DMEM、RPMI-1640、TC199、MEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定；成本低

6、。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要，只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。所以合成培养基又称为基础培养基。血清血清中含有：激素、生长因子、结合蛋白、贴壁因子等，所以能促进细胞的生长和增殖。常用血清为牛血清（包括胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清，其中以胎牛血清质量最好）。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清质量好坏是实验成败的关键。血清的使用和储存：使用前处理：灭活，消除补体活性，56℃，30分钟储存条件：血清一般储存于－20℃，同时应避免反复冻融。使用浓度：一般为5－20％，最常用是10％。血清的

7、消毒：过滤除菌基础培养基除需补充血清外，为防止污染培养液中还要添加一定量的抗菌素，有的细胞（如上皮细胞、内皮细胞、神经细胞）还要添加谷氨酰胺。基础培养基添加血清、谷氨酰胺和抗菌素等物质后，叫（血清）细胞培养基也叫完全培养基。完全培养基的组成：基础培养基80％一95％灭活小牛血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/LHepes2.7~5.4g青、链霉素各100卑位／毫升碳酸氢钠和Hepes：主要作用是防止培养基pH迅速变动。Hepes是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌