动物毒理学实验二 小鼠骨髓细胞微核试验.ppt

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1、实验二小鼠骨髓细胞微核试验2实验原理微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反应骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试药物是否具有致突变作用,主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成3实验材料3.1器材解剖器械，显微镜，载玻片等。3.2试

2、剂甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、Giemsa储备液、pH6.8磷酸盐缓冲液、小牛血清、生理盐水3.3药物环磷酰胺3.4动物小鼠7-12周龄，体重20-30g，雌雄各半。4操作步骤4.1给药环磷酰胺生理盐水溶液按50mg/kg剂量腹腔注射2次，间隔24h。空白对照：生理盐水4.2骨髓液的制备和涂片试验动物第二次染毒6小时后用颈椎脱臼或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉。在洁净的玻片滴小牛血清1滴，剪去骨骺，用止血钳将骨髓挤到血清中，混匀，推片，干燥。4操作步骤4.3固定将推好晾干的骨髓片放入染色缸

3、中，甲醇液固定5-10min，取出，晾干。不能及时染色的涂片也应固定好保存。4操作步骤4.4染色将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa染液(Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐缓冲液9份)染色10-15min，冲洗，晾干。1/15mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.8)磷酸二氢钾(KH2PO4)4.50g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)11.81g加蒸馏水至1000mL4操作步骤嗜多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈粉红色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核

4、质一致，呈紫红色或蓝紫色。4.5观察计数低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，再在油镜下观察计数。计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数至少200个细胞（PCE+NCE≥200个）中PCE与NCE的比值。4操作步骤MNNCE5结果记录细胞总数微核细胞数微核率（‰）PCE数NCE数PCE/NCE空白组染毒组表微核率统计嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数×1000‰正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常。6结果分析与评价本试验中

5、只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCE值与阴性对照组比较有统计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。正常PCE/NCE约为1（正常范围0.6-1.2），如比值小于0.1，表示PCE形成受到严重抑制；如比值小于0.05，表示受试物剂量过大，实验结果不可靠。