小鼠骨髓细胞微核试验

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1、小鼠骨髓细胞微核试验1目的通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法。2原理微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。微核成因化学致突变物染色体作用于纺锤丝无着丝点,片或环整条染色体带着丝粒的环和断片于细胞分裂末期细胞质中形成微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成因此，微核试验用于检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂。微核可出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常

2、核的分支相区别，由于红细胞在成熟前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此，通常计数PCE细胞中的微核数。3器材与试剂3.1器材解剖器械，生物显微镜，载玻片等。3.2试剂甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液、pH6.8磷酸盐缓冲液3.3阳性对照物环磷酰胺4操作步骤4.1试验动物及处理动物选择小鼠是微核试验的常规动物，通常用7～12周龄，体重18～20g的小鼠。每组10只，雌雄各半。剂量及分组受试物应至少设三个剂量组，最高剂量组原则上为不产生动物死亡的最大毒作用剂量。一般取受试样品1/5、1

3、/10、1/20LD50剂量。另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺腹腔注射1次。阴性对照组使用等体积的溶剂。染毒途径腹腔注射染毒次数及取样时间一般采用两次或多次染毒。两次染毒：第一次染毒后24小时进行第二次染毒，6小时后取样；多次染毒：每天染毒1次，连续5天，末次染毒后24小时取样。4.2骨髓液的制备和涂片试验动物一次染毒后，按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型止血钳将骨髓挤于有一小滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片。也可在股骨取骨髓。阳性及阴性对照组处理方法同上。4.3固定将推好

4、晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇溶液固定15分钟，取出，晾干。不能及时染色的涂片也应固定好保存。4.4染色将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa(Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐缓冲液9份)染色10~15分钟，冲洗，晾干。4.5观察计数低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，再在油镜下观察计数。多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈橘黄色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。5结果分析

5、与评价本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCE值与阴性对照组比较有统计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。阴性对照和阳性对照组的微核发生率，应与相关文献报道或研究历史数据相一致。MNNCE红细胞电镜单个微核多个微核