高中生物专题2微生物的培养与应用课题3分解纤维素的微生物的分离素材二.doc

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1、专题2微生物的培养与应用课题3分解纤维素的微生物的分离庖丁巧解牛知识•巧学一、纤维素与纤维素酶纤维素是地球上最常见的多糖，其组成元素是C、H、O，纤维素的基本组成单位是葡萄糖，这一点和淀粉是相同的，但是由于和淀粉的结构不同，它们的物理化学性质也大不一样。淀粉进入人体后能在淀粉酶和麦芽糖酶的作用下彻底分解成葡萄糖，用于各项生命活动；而纤维素在人体内不能被消化吸收，但是它可以促进人体肠胃的蠕动，增加排便次数，因此对人体健康是极为有利的。纤维素酶是一种复合酶，由三部分组成：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，只有在这三种酶的协同作用下，纤维素才能彻底分解成葡萄糖。动物细胞中都没有纤维素，也没有纤

2、维素酶，因此纤维素不能被动物直接利用。知识拓展纤维素酶可以作为畜禽的饲料添加剂，其作用机理在于它可以打破植物的细胞壁，使胞内的原生质暴露出来，由内源酶进一步降解。这样除了细胞壁能分解供能外，胞内物质的消化利用率也得到了提高，从而有效地提高了饲料的利用率。误区警示草食动物并不能直接利用植物体内的纤维素，它们能以植物为主要食物的原因是其胃中生活着一些微生物，这些微生物能分泌纤维素酶，将纤维素分解成葡萄糖，被动物利用，同时它们也能从动物体内获得各种养料，因此它们和动物是共生关系。二、纤维素分解菌的筛选一般情况下，我们都是先用选择培养基对土壤中的纤维素分解菌进行粗筛，然后用刚果红染色法进行细

3、筛，刚果红是一种酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水和酒精，它能把胶质和纤维素染成红色，当纤维素被酶分解后，刚果红—纤维素复合物就无法形成，从而在固体培养基上形成一个以菌落为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来鉴别有无纤维素分解菌的存在。疑点突破纤维素分解菌的选择培养基是液体培养基，和固体培养基相比，它有利于营养物质的充分利用，并可以增加纤维素分解菌的浓度。只有能够产生纤维素酶的微生物才能分解纤维素作为碳源和能源，其他微生物由于不能利用纤维素，会因缺乏碳源和能源而死亡，因此该培养基具有选择作用。三、实验设计：分离分解纤维素的微生物1.土壤取样在富含纤维素的潮湿的土壤中，用无

4、菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土壤并装入无菌信封，密封。2.选择培养将土样加入装有30mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2天(如果没有摇床，可以采用定时人为摇晃锥形瓶的办法)，直至培养液变混浊。吸取一定量的培养液(如5mL)，转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变混浊。吸取适量的培养液，稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。对照组用同样量的富集后的培养液，稀释涂布到不含纤维素的培养基上。3.梯度稀释用lmL无菌吸管从富集培养后的培养液中吸取lmL，注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，使之充分混匀；然后再用一支1mL无菌吸管从

5、此试管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中，以此类推，制成101、102、103、104、105、106倍的各种稀释液。4.涂布培养4在含鉴别培养基的三个平板上分别用记号笔标记：104、105、106倍的三种稀释液，另取三个不含纤维素的培养基平板，分别用记号笔标记：104、105、106倍的三种稀释液；然后用三支lmL无菌吸管分别从104、105、106倍的三管稀释液中吸取0.1mL对号放入已标记了稀释度的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。将培养基平板倒置于30～37℃的温室中培养1～2天，每隔24h观察菌落情况。5.筛选菌株（1）刚果红染色法常用的刚果

6、红（CongoRed，简称CR）染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg／mL的CR溶液，10～15min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为1mol／L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。方法二:配制质量浓度为10mg／mL的CR溶液，灭菌后，按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。实验组经刚果红染色法，菌落周围将会出现明显的透明圈

7、，而对照组，不含纤维素的培养基经刚果红染色法，菌落周围不出现明显的透明圈。辨析比较两种刚果红染色法的比较。刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但