实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法与应用【本科临床医学论文设计下载】.doc

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1、临床医学论文•实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法与应用作者：陈丽李红海鲁勇李向阳杨锦红【摘要】冃的：建立检测阴道加德纳菌的实时荧光定量PCR方法，用于细菌性阴道病的诊断。方法：按照Amsel诊断标准诊断细菌性阴道病；定性PCR检测患者阴道分泌物中的阴道加德纳菌;实时荧光定量PCR测定患者阴道分泌物中的阴道加徳纳菌的DNA含量，同时测定标本中总的细菌16SrRNA的DNA含量进行校正，即用阴道加德纳菌的DNA含量/16SrRNA的DNA含量比値來表示阴道加德纳菌的相对含量。用受试者工作曲线(ROC)评价对

2、细菌性阴道病的诊断价値。结果:定性PCR的特异度为31.9%敏感度为93.2%°实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌含量的线性范围1x10〜1x105拷贝数/ml。阴道加德纳菌在细菌性阴道病中的相对含量为0.5613400，明显高于霉菌性阴道炎(PvO.Ol)、其他阴道炎(PvO.Ol)及健康体检者(P<0.01)，但与滴虫性阴道炎无明显差异(P>0・05)oROC曲线分析结果显示，曲线下面积(AUCROC)为0.909当阴道加德纳菌的DNA含量/16SrRNA的DNA含量的截断値为0.1026035时，其诊断

3、细菌性阴道病的总体敏感度和特界度分别为92.9%和80.3%。结论：实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法敏感度和特异度较高，准确性和重复性良好。对细菌性阴道病的诊断有一定的临床应用价値。【关键词】阴道加德纳菌细菌性阴道病实时荧光定量PCR诊断价値细菌性阴道病（bacterialvaginosis,BV）是育龄期妇女常见疾病。在BV患者与健康妇女中，阴道加徳纳菌（gardnerellavaginalis,GV）检出率存在明显差异。在BV的微生物菌群中GV处于优势地位，数量明显高于其他非正常菌群［1］。目前对

4、阴道加德纳菌的实验室诊断主要有直接涂片革兰染色找线索细胞、细菌分离培养、免疫荧光法以及PCR等［2〜4］。本实验建立检测阴道加德纳菌的实时荧光定量PCR实验诊断方法，用于细菌性阴道病的快速诊断。1资料与方法1・1硏究对象2008年3月〜2008年5月在本院妇科门诊就诊者141例，通过盐水湿片法对阴道分泌物进行检查，按照Amsel诊断标准［5］:①阴道pH値＞4.5；②阴道分泌物增多、稀薄、有异味；③阴道分泌物加10%KOH可闻到鱼腥味；④涂片可见线索细胞。以上4项指标中3项阳性者判定为BV，共44例。滴虫性阴

5、道炎12例，霉菌性阴道炎25例，其他阴道炎30例，健康体检者30名。患者（除外健康体检者）主诉有程度不同的阴道分泌物异常，外阴瘙痒，泌尿系症状及腰痛和下腹痛等症状，病程为3〜10天，年龄23〜50岁，均已婚未孕，就诊前3天无阴道灌洗和用药。月经期和绝经后妇女除外。1.2主要试剂与仪器DNA聚合酶及其缓冲液、Mg2+、dNTPs、RNA酶、PCR产物纯化试剂盒、SYBRPremixExTaq（大连宝生物有限公司），低温离心机，普通PCR仪（美国ABI公司DNAThermalcycler），琼脂糖凝胶电泳仪（北京

6、六一仪器厂，DYCP-31D型），凝胶照像系统（上海复日科技公司），DU紫外分光光度仪（美国Beckman公司）‘ABT7500PCR仪（美国ABT公司）。1.3引物设计与合成阴道加德纳菌的引物合成参照文献［6］,序列如下：上游引物：5"TTACTGGTGTATCACTGTAAGG3',下游引物：5，CCGTCACAGGCTGAACAGT3'；16SrRNA的引物合成参照文献［7］，序列如下：上游引物：5"AGGAGGTGATCCAACCGCA3",下游引物：5"AACTGGAGGAAGGTGGGGAT3'，

7、由上海生物有限公司合成。1.4模板制备将溶于0.5ml无菌生理盐水的阴道分泌物，13000g/min离心30min,弃上清，加入400//I溶菌酶裂解液［5mmol/LNaCl，20mmol/LTrisHC1(PH8.0)4mmol/LEDTA蔗糖^Omg/ml溶菌酶］，置37t水浴箱20min；加入500/zg/mlRNA酶10/zl，置37°C水浴箱lOmin:加入100//110%十二烷基硫酸钠，置37°C水浴箱30min；用饱和酚/氯仿/异戊醇抽提上层水相3次，经预冷无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤

8、沉淀2次，室温风干，最终溶解于20“1的TE缓冲液中，置・20°C保存备用。1.5PCR扩增PCR反应体系为10xbuffer2.5/zl^NTPs(各2.5mmol/L)2“1，TAKARATaq(5U///1)0.125/z1,MgC12(25mmol/L)l.5“1,上下游引物分别各为0・5Q(20/zmol/L)，模板为3Q，用双蒸水补足至25“1(50/z1体系为各种成分体积增加1倍)。P