ELISA实验、酶标仪、洗板机的原理和使用.ppt

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1、ELISA实验、酶标仪、洗板机的原理和使用酶标（ELISA）ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。1.ELISA的原理2.ELISA的类型3.试剂准备：免疫吸附剂结合物酶底物的准备4.对照设定5.标本的采取和保存6.结果判断ELISA是一种免疫测定。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底

2、物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。1.ELISA的原理ELISA技术原理1.抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。2.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。3.酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。4.受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。5.此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。6.加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

3、测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。1.1抗原抗体反应1.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。1.1.2特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的

4、物质，而不需先分离待检物。1.1.3最适比例1.1.4敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。2ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。双抗体

5、夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。样品（抗原）酶标抗体底物酶标仪测定OD值终止液双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。3.ELISA的试剂(A、B、C三部分)ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的

6、固相载体（免疫吸附剂）；A（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；B（3）酶的底物；C（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液3.1ELISA的试剂准备A固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充

7、填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。洗涤液：在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。3.2ELISA的试剂准备B结合物即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂1.酶的催化活性2.抗体（或抗原）的免疫活性3.含有或少含有游离的抗体（或抗原）4.结合物尚要有良好的稳定性。酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底

8、物易于制备