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1、化学发光免疫分析法（CLIA）A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）一、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B0值越小。例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应
2、生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU），测定尿液中A的含量。二、仪器：1、Flash’nglowLB95530管全自动进样冷光分析仪(Berthold公司);2、高速离心机(Beckman公司),转速13000r/min3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制,磁场强度2800高斯)1、XW80旋涡混合器(上海精科实业有限公司)2、试管12×60mm(浙江拱东医用塑料厂)3、磁性微粒子(磁性分离剂,Adaltis公司)三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体3、A-BSA结合物4、抗
3、FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）5、FITC标记的A单克隆抗体6、HRP标记的A7、PBST洗涤液(0.05mol/LPBS,含0.05%Tween-20)8、分析缓冲液(0.05mol/L的PBS缓冲溶液,pH7.4,含2.0%BSA、0.5%的水解明胶、0.1%的Proclin-300)9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液)实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液,梯度稀释标准品；2、取A-BSA-HRP溶液,以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000的A-
4、BSA-HRP溶液,4℃保存.FITC-A单克隆抗体溶液的配制:取FITC-A单克隆抗体溶液,以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000的FITC-A单克隆抗体溶液,4℃保存。（具体分析）五、数据处理通过测量标准品和样品溶液的发光强度(RLU),使用Flash’nglowLB955发光分析仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理.线性方程采用的是logit(Y)-log(X)的线性回归数学模型,以logitY为纵坐标,logX为横坐标,其线性方程表达式为logi
5、t(Y)=a+blog(X),线性方程中X为标准品(或待测样品)溶液的浓度,logit(Y)=ln（y/1-y）,y=B/B0,式中,B为标准品(或待测样品)溶液的发光强度,B0为不加标准品(或待测样品)而加分析缓冲液的发光强度.根据标准品的浓度和发光强度值,经线性回归得标准曲线,代入样品的发光强度值得样品的浓度。B、板式磁性微粒子化学发光免疫分析法（双抗体夹心法）：一、原理：以磁性微粒子作为分离固相，96孔板为反应容器，辣根过氧化物酶（HRP）催化H2O2-liminol化学发光体系作为检测体系。采用双抗体夹心法，在溶液中形成FI
6、TC-抗体—抗原-HRP复合物，引入偶联FITC抗体的磁性微粒子，在反复施加磁场的作用下，通过洗涤将没有结合的游离蛋白与免疫复合物分离，以辣根过氧化物酶（HRP）催化H2O2-liminol化学发光体系作为检测体系，实现对待测抗原的检测。二、仪器1、BHP9504微孔板化学发光分析仪(北京滨松光子技术有限公司,北京);2、管式发光分析仪(Berthold技术有限公司,德国);3、DEM-III型洗板机(北京拓普分析仪器有限公司,北京);电热恒温水浴箱(北京长安科学仪器公司,北京);4、XW-80A旋涡式震荡混合仪(上海精科实业有限公
7、司,上海);5、白色不透光96-孔微孔板(英科新创科技有限公司,厦门);6、磁分离器采用美国Promega公司的Magnabot96磁分离装置.三、试剂1、A标准品以及配对的A单克隆抗体均购自Fitzgerald公司(康科德,美国);2、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)以及Tween20购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯,美国);3、化学发光底物(鲁米诺和H2O2)来自美国的DPC公司;4、牛血清蛋白(BSA)购自德国的Merck公司;抗FITC抗体包被的磁颗粒悬浊液(粒径:2.8μm,浓度:5mg/m
8、L)购自意大利的Adaltis公司.5、96孔微孔板先用300μL含1%(w/V)的BSA的磷酸缓冲液(PBS)在4℃封闭12h;整个实验过程中的冲洗液为浓度是0.01mol/L的磷酸盐缓冲液,含0.05%吐温-20(V/V).6、正
