microRNA实验方法.doc

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1、microRNA实验方法作者:MaryJohnson如果您想将您的microRNA实验方法,或想更新这里microRNA实验方法信息.请与我们联系。概观miRNAMicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的小RNA分子，通过与靶RNA的3´UTR互补或部分互补结合，使其降解或介导其翻译抑制，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程.miRNAs基因通常位于基因间或编码蛋白基因的内含子中，在核内由RNA聚合酶II或III转录产生具有特征性茎环结构的pri-miRNA,然后在Drosha-DGCR8复合体的作用下，剪接成70nt的pre-miRNA,它由exporti

2、n5由核内运到胞浆。在胞浆内，pre-miRNA在Dicer酶作用下剪切成22bp的成熟双链miRNA,其中的一条链与RISC结合而参与基因转录后水平的调控。根据miRBase数据库，目前所发现的miRNAs已超过700个，随着高通量测序的应用，将会有更多的新的miRNAs被发现。可能近90%的人类基因受到miRNAs调控，然而，当过表达或抑制某一个miRNA时，在发生调变的众多基因当中寻找并鉴定其中起关键作用的靶基因仍然具有相当大的挑战。目前鉴定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息学软件预测，结合基因芯片分析以及生物学实验方法来研究miRNA的功能及寻找其中起重要作用的靶基因。此外，

3、利用蛋白质质谱来寻找miRNA靶基因也成为一种新的途径。microRNA的筛选在上千个miRNA中，哪些miRNA在特定的生物学功能起着关键的作用呢？这是研究miRNA功能所面临的首要问题。miRNA基因技术可以快速有效的提供miRNA表达图谱。通过比较正常样本与疾病样本中miRNA表达图谱的差异，寻找在生物学功能上起作用的miRNA。该技术为临床肿瘤诊断提供了新的思路，也为miRNA作为肿瘤的标志物提供了依据。然而基因芯片技术的结果是半定量的，且重复性较差,这就需要通过其它的实验方法来进一步验证。miRNA的实验验证为了进一步验证miRNA在组织细胞内的表达，目前常用来检测miRNA的技

4、术主要有以下几种：Northern杂交;原位杂交;Stem-loop实时定量RTPCR.这三种技术各有利弊，可以相互结合应用，来反映细胞内miRNA的真实表达水平。Northern杂交MicroRNA是一类很小的分子，部分microRNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究有一定困难，特别是重复性较差，步骤繁琐等。目前多数研究人员采用NorthernBlot，它是一种重复性好、灵敏高、直接的方法,可以用来检测microRNA的存在、表达量的变化等。而由于放射污染等原因，同位素标记的探针的使用有一定的局限性。而Exiqon公司推出

5、的锁核苷酸（locked-nucleicacid,LNA）探针，具有稳定性高、特异性好、无放射污染等优点，成为新的NorthernBlot检测探针[1] [2] [3]。图1. Northern杂交表明从人类和小鼠来的前miR-499和成熟miR-499条带。来源于 [6]。基本原理：将待检测的RNA分子变性后，通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,继而按其在凝胶中的位置转移到尼龙膜上，固定后再与同位素、地高辛或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片

6、段及其相对大小。用途：检测样品中的RNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。实验过程1.提前配制无APS和TEMED的15%的Ura-PAGE胶的混合液，即50mlofPre-Gels：1.Urea:24g2.40%Acrylamide:18.75mL3.5xTBEBuffer:10mL4.ddH20:0mL2.器皿的清洗：器皿同WesternBlotting装置。1.用清水冲洗干净，乙醇擦干3%；2.H2O2填充浸泡电泳槽、玻璃片、梳子10分钟；3.用0.1%DEPC处理过的水冲洗电泳槽，梳子和玻璃片。4.用RNAaseAway擦海绵和其他相关器材。5.安装配胶装置。3

7、.配胶：取10mlPre-Gels，加入33.3-45ul的APS和10-20ul的TEMED，混匀，加入玻片中，加入10或15齿梳子。大约30-60min即可凝好。4.RNA样品的准备SmallRNAs（大约107细胞）（或者TotalRNA~20-200ug）在~18ulDEPCH2O加入2ul10xRNAloadingbuffer。95℃加热5min,冰上冷却。瞬时离心收集RNA样品。5.电泳：（装置同Wester