PCR技术讲座.ppt

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1、PCR技术讲座（二）常规PCR技术及几类PCR新技术的介绍热启动PCRTouch-downPCRRT-PCR兼并引物PCR巢氏PCR反向PCR不对称PCR原位PCR连接酶链反应RACE-PCRAFLP免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特异PCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而

2、受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动PCR热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入TaqDNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡

3、熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。PlatinumDNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。PlatinumTaqDNA聚合酶的成分为复合有抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体的重组TaqDNA聚合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在94℃－95℃下加热数分钟才能够恢复酶活性。同经化学修饰用于热启动的TaqDNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaqDNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的TaqDNA聚合酶活性。热启动P

4、CRTouch-downPCR又称降落PCR。即选定一个温度范围，如50—35℃，每降1-2℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。Touch-down的原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度Touch-downPCRlowcopyoftargetedDNA;highdegreedegeneracy(orlessspecific)ofthefirstsetof

5、primers;RT-PCRusingoligo-dT.Touch-downPCR的应用范围RT-PCRRNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reversetranscription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。RNA扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNADoublestrandcDNAAAAAATTTTTRTAAAAATTTTTRTRTAAAAA

6、TTTTTOligodTprimerisboundtomRNAReversetranscriptase(RT)copiesfirstcDNAstrandReversetranscriptasedigestsanddisplacesmRNAandcopiessecondstrandofcDNART-PCRA.DoublestrandDNAB.Denature96º50ºC.Annealprimers50ºD.Polymerasebinds72ºTaqTaqRT-PCRcDNA第二链的合成方法有以下几种:　　(1)自身引导法合成的单链cDNA3'端能够形成一短的发夹结构,这

7、就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。　　(2)置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系