利用CRISPRCas9系统定点敲除杨树和烟草PDS基因的研究.pdf

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1、摘要CRISPR/Cas系统作为一种全新的基因编辑工具，目前正被广泛的研究与应用。已经报道在拟南芥、烟草、斑马鱼、以及小鼠等多个物种中实现了基因特定位点的敲除。而对于多年生的木本植物来说，CRISPR/Cas系统的应用还很少。八氢番茄红素脱氢酶—PDS，介入参加了合成类胡萝卜素的过程，是合成过程中的关键酶之一。该过程中，PDS作为酶的一类，发挥的主要功能是将八氢番茄红素从没有颜色的状态转变成有色状态的类胡萝卜素。目前，对于PDS基因功能的验证和研究已经十分广泛，并且在细菌、藻类和高等植物中的多个物种中，得到了相应的核酸和蛋白序列。杨树和烟草的基因功能研究以及遗传转化体系一直以来是我们

2、实验室的主要研究内容，鉴于CRISPR/Cas系统应用的日益成熟，本实验利用该系统分别就杨树和烟草两个物种设计了Pt-sgRNA+Cas9和Nb-sgRNA+Cas9两个敲除载体，对选取的杨树和烟草的PDS基因，进行特定靶点的定向敲除，探索CRISPR/Cas系统在植物中的应用规律，建立CRISPR/Cas系统在木本植物中的应用体系。得到的研究成果总结如下：1.根据在拟南芥中报道的基因登录号AF360196，获得杨树以及拟南芥PDS基因的全部序列，对蛋白序列进行Blast比对，构建进化树，选择与拟南芥白化基因亲缘关系近的基因作为本次实验敲除的对象。2.对预敲除的基因序列进行外显子、内

3、含子分析，选择靶点，评估靶点的脱靶效应，选取脱靶效率最低的敲除靶点。3.根据烟草基因敲除成功的文献中，挑选其中敲除效率较高的一个靶点。4.在确定好杨树和烟草的敲除靶点后，根据靶点分别设计gRNA，构建Pt-sgRNA+Cas9和Nb-sgRNA+Cas9两个重组载体。对构建成功的两个重组载体进行PCR验证、酶切验证，将验证正确的阳性克隆测序，确保载体的正确性和完备性。5.将验证正确的载体转化农杆菌，利用农杆菌分别介导杨树（南林95）以及烟草的遗传转化，获得转基因苗。6.对转基因苗进行PCR检测，初步筛选确定载体成功导入到烟草当中，观察其表型并与实验室正常组培苗比较，发现转基因烟草苗，

4、在形态上呈现出矮小；叶片颜色上呈现白化的表型特征。关键词：杨树，PDS基因，遗传转化，烟草，CRISPR/Cas9IAbstractCRISPR/Cassystemasanewgeneeditingtool,isnowwidelyresearchandapplication,havebeenreportedimplementedgeneknockoutofspecificsitesinmanyspecies,suchas,Mice,Arabidopsis,Tobacco,Zebrafish.Buttheusingofthissystemintheplant,especiallythe

5、perennialwoodyplantswerepoor.Eighthydrogenlycopenedehydrogenase(PDS),isoneofthekeyenzymesofcarotenoidssyntheticroute,whichcantranslatecolorlesslycopeneintonon-ferrouscarotenoids.Presently,thefunctionsofthePDShavebeenextensiveresearched,andthecorrespondingnucleicacidsandproteinssequencesofPDSins

6、omespecieslikebacteria,algaeandhigherplantshavebeenidentified.Keylaboratoryofsouthwestuniversityoftransgenicplantsandsafetycontrolusedthegeneeditingtechniquestofixed-pointknockoutexperimentsforpoplarPDS.Theresearchofpoplarandtobaccogenefunctionsandtheirgenetictransformationsystemsisthemainresea

7、rchcontentofourlaboratory.Inthisstud,wedesignedthecarrierofCRISPRtoknockoutPDSgeneinpoplarusinggeneeditingtechnology.Themainresultsarefollowing:1.Accordingtoaccessionnumber:AF360196fromArabidopsisthalianadatabase,weobtainedthepopl