食品生物技术.ppt

《食品生物技术.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、酶解反应与膜分离耦合连续制备酪蛋白磷酸肽主要内容引言材料与方法理论分析结果与讨论结论2引言酪蛋白磷酸肽酪蛋白磷酸肽(CPPs)是以乳酪蛋白为原料经酶解、分离、纯化而制得的含有成簇磷酸丝氨酸残基的活性多肽,它具有多种特殊的生理功效,尤其是促进Ca、Fe等元素高效吸收的功能使其具有“矿物质载体”的美誉。酶解反应-膜分离耦合技术酶解反应-膜分离耦合技术是集酶促水解、催化剂回收再用、产物分离纯化、苦味肽脱除等多步工序于一体,是实现连续操作的有效模式。3引言本文是将连续流动搅拌釜式-超滤膜（CSTR/UF）组合酶膜反应器应用于活性多肽的高效制备过程,考察操作

2、变量对反应器性能和酶解反应转化率的影响规律；利用高效凝胶排阻色谱系统测定酶解物系相对分子质量分布；比较间歇与连续水解反应过程特性；并建立连续酶解反应动力学模型,为生物反应器的进一步工业放大提供理论基础。41.材料与方法1.材料：酪蛋白胰蛋白酶甲醇其他试剂（均为分析纯）2.实验仪器：自动电位滴定仪双光束紫外分光光度计HPSEC系统：WDL-95色谱工作站,P200II型高压恒流泵,UV-200II紫外可变波长检测器,排阻色谱柱中空纤维超滤膜51.材料与方法3.方法连续酶解步骤与检测在图1所示装置中进行连续酶解反应,维持体积、温度、pH、搅拌速率恒定

3、,定时对截留液和渗流液取样检测。蛋白质含量测定采用标准蛋白紫外分光光度法；蛋白酶活性测定为F.I.P紫外分光光度法。酶解产物色谱分析过程将连续酶解工艺所得截留液与渗流液，用0.45m微孔滤膜过滤后,按如下HPSEC操作条件进行色谱分析：流动相为0.1mol/L，pH=7磷酸缓冲液；流速0.5mL/min；进样量20L；检测波长280nm；检测时间45min；柱温25。停留时间分布函数实验测定循环体系先以磷酸缓冲液做补液,待渗透通量稳定后,将补液迅速切换为已制得的多肽水解液(经6000Da中空纤维膜过滤),并连续检测280nm下渗流液的吸光度值变

4、化。61.材料与方法72.理论分析动力学模型推导如下：对连续酶解反应过程做如下简化与假设:①近似认为超滤膜组件对胰蛋白酶及酪蛋白完全截留；②酶解前经底物循环保护后可忽略膜组件对该酶的活性影响；③酶解单元遵循单底物拟均相不可逆酶促反应动力学方程；④酶解操作达稳态时因体积V反应器》V中空纤维膜，渗透通量J循环》J渗流，故可认为CSTR/UF的动力学行为近似等效于CSTR；⑤暂不考虑物质在膜上的传质行为。8上式中,ρso为初始底物质量浓度，g/L；ρeo为初始酶质量浓度,g/L；r为酶解反应速率,mol/(L)min)；Km为米氏常数,g/L；kcat为

5、酶转换数；X为酶解反应转化率；τ为修正空时。2.理论分析93.结果与讨论3.1膜选择性研究图2(a)表明,渗流侧的残存酶活无论有无底物循环始终很低(<5%),说明所用超滤膜对胰蛋白酶几乎完全截留；而截留侧差别很大,当有底物循环保护时,由于大分子酪蛋白先于胰蛋白酶吸附于膜上,再进行酶液循环时,大量酶分子仍以活性可溶状态存在,使得截留侧酶活较高,因而有利于酶的重复利用。由图2(b)可见,截留侧始终保持很高的蛋白质含量(>95%)；而渗流侧蛋白质质量浓度较低,说明酪蛋白很难透过超滤膜而近于完全截留,故有利于反应分离耦合连续水解工艺的实现。以上2项实验结果

6、与模型推导中所作假设(1)和(2)一致。103.结果与讨论3.2操作变量对反应转化率X及反应器生产能力K的影响规律X及K值可有效表征反应器的性能特点,是衡量连续水解工艺的重要参数。结果如图3和图4所示。11将ρso、ρeo、V、J4个参数归并为酶与底物质量浓度比(ρeo/ρso)以及平均停留时间t(V/J)二组合变量来描述反应器性能。图3中X随ρeo/ρso的增大以乘幂规律平缓上升,而K则大幅降低,连续酶解时,增加底物质量浓度可在一定范围内最大限度地利用蛋白酶,但底物转化率相对减小,而增加酶质量浓度将使同样数量的底物降解更彻底,转化率更高,但单位酶

7、产量相对减少;图4中V、J二参数对X及K值作用相反,影响规律与t值密切相关,V增大或J减小都将使t增大,这意味着酶与底物有充分的混合接触时间而使X以指数规律提高,而K值定义式决定的反应器生产能力则随t增大而减小。123.结果与讨论3.3酶解物高效凝胶排阻色谱柱分析及膜截留率δ计算133.结果与讨论对各谱峰面积积分并修正计算后求得中空纤维膜对相对分子质量<6000的目标多肽的表观截留率为71.23%。由图可知:(1)稳态时渗流液与截留液均以相对分子质量相对较小的多肽为主,说明连续水解较之间歇酶解因消除了产物抑制等多种因素而使降解更彻底,转化率更高,有

8、利于提高水解度；(2)超滤膜对体系中相对分子质量>6000Da的原始底物与大肽有着较好的截留效果,同时酶解过程中不断形成的