信号肽在基因工程的应用.ppt

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1、信号肽在基因工程的应用主讲人：钟鸣成员：黄玲信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列。（有时不一定在N-末端）信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。信号肽的结构特点前端（Ns端）：介于-1～+5之间，均带正电荷的碱性aa残基作用：可能和信号肽序列受体（SSR

2、）结合有关。　　中部(Hs区域)：12～14个aa残基组成疏水片段Met.Leu.Phe。作用：1）高度疏水，倾向于α—螺旋。有利于与脂质双层作用，促进新生肽链过膜。2）Hs与信号序列识别颗粒（SRP）结合有关(SPR将新生肽链核糖体和RER膜靠近)后端（Cs1,Cs2）：富含A/a，易形成β—折叠，有利于肽链断裂。作用：是位于RER膜上的信号肽酶复合物（SPC）水解部位，切除信号肽，使新生肽链也能进入RER。注意：1）信号肽的疏水片段较重要，因为如果利用点突变将其中心的疏水aa换成亲水aa，信号肽的功能丧失。2）信号

3、肽不一定位于分泌蛋白的N端。例如：真核细胞的卵清蛋白N端26～45个aa可能具有信号肽作用，这样的信号肽称为内含信号肽。3）有些比较复杂的膜蛋白（如视蛋白Opsin）可以含有一个以上的信号肽，这些信号肽不一定会被水解。信号肽分泌蛋白的转运过程分泌型表达载体----基因工程技术与应用分泌型表达载体信号肽ATG信号序列插入位点终止子分泌型表达载体——原核原核常用的信号肽：碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A的信号肽pTA1529----phoA(碱性磷酸酶)pINⅢ系统----ompa（外膜蛋白)PEZZ18----蛋白ApTA15

4、29大肠杆菌phoA（碱性磷酸酶）启动子和信号肽序列。外源基因插入到信号肽序列后的酶切位点。在磷酸盐饥饿时，外源蛋白表达。由周质信号肽酶切下信号肽。pINIII系统D下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。pINIII-A1：plasmidds-DNA7400BPpINIII-A2：plasmidds-DNA8900BPpINIII-A3：plasmidds-DNA7400BPIpp（脂蛋白基因）启动子Tac启动子：IPTG诱导转录。信号肽序列：大肠杆菌中分泌蛋白外膜蛋白(ompa)；EcoRⅠ、Hi

5、ndⅢ、BamHⅠlac阻遏子的基因（lacI）pEZZ18Plac：Lac启动子Pspa：金黄色葡萄球菌蛋白A启动子S：蛋白A的信号肽序列两个合成的Z功能域（结合lgG，琼脂糖层析柱）2分泌型表达载体——真核酵母常用信号肽序列：α因子、酸性磷酸酶（PHO5)、蔗糖酶（SUC2）等的信号肽。α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽及后面的一段由Lys-Arg(Glu-Ala)l-2或Lys-Arg-Glu-Ala-Asp-Ala氨基酸序列组成的问隔肽。膜结合蛋白酶KEX2基因产物识别Lys-ArgC端，STEl3基因产物则识别

6、(Glu-Ala)l一2或Asp-Ala外侧。常用的分泌表达载体有：pPIC9K、pPICZα、pGAPZα系列——α因子分泌型表达载体——真核Zeocin:博莱霉素MCSPGAP甘油醛三磷酸脱氢酶启动子：组成型表达启动子MCSS新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX组成型启动子GAP启动子毕赤酵母表达载体pGAPHα的构建毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2的构建a—Factor信号肽克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU毕赤酵母表达载体pGAPHI-xyn2的构建BglⅡ酶切构建好的2

7、种新型毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2和pGAPHI-xyn2，使质粒线性化，电击法转化毕赤酵母GS115，筛选转化子。在培养基中震荡培养48h，离心取上上清液，测定木聚糖酶活性，以毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9-xyn2为对照，实验结果如表：2融合gp67信号肽的慈菇蛋白酶抑制剂基因在蚕体内表达1.重组转移载体pBacPAK-gpAPI2的构建pBacPAK-gpAPI2的ph.p、gp67信号肽序列和API2基因的连接处序列为:2.重组病毒的筛选及表达产物分子量测定3.血淋巴中表达产物含量的测定表达产物经SDS

8、-PAGE电泳,脱色后用凝胶干燥仪干燥,用Bio-RadGS-670图像分析仪进行扫描处理。测得CrBK-API4感染的血淋巴上清液中表达的API占可溶性蛋白含量的9%,CrBK-gpAPI2感染的血淋巴上清液中表达的API占可溶性蛋白含量的7%。血淋巴中可溶性蛋白总量测定表明:CrBK-API4感染的