单克隆抗体制备实验过程.doc

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1、单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8

2、个点为宜。2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。二、细胞融合（Cellfusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操作取出脾

3、脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿

4、入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5mlHAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。（4）主要试剂的配制①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（DulbercoModifiedEaglesMedium）两种基础培养基，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml100×L

5、.G.溶液1ml双抗溶液1ml7.5%NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml不完全DMEM培养基：DMEM13.37g超纯水或四蒸水980mlNaHCO33.7g双抗溶液10ml100×L.G.溶液10ml用1NHCl调试PH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml小牛血清15-20mlHT或HAT培养基：HT培养基HAT培养基完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml98mlHT贮存液1ml1mlA贮存液1ml②氨基喋呤（A）贮存液（100×

6、，4×10-5mol/L）称取1.76mg氨基喋呤（AminopterinMW440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100×，H：10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L）称取136.1mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，MW136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，MW242.2），加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过

7、滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。④L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）称取2.92gL-谷氨酰胺（L-glutamine，MW146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。⑤青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。⑥7.5%NaHCO3溶液称取分析纯NaHCO37.5g，溶于100ml超纯水

8、或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。⑦HEPES溶液（1mol/L）称取23.83gHEPES（N-2-Hydrox