4-核酸分子的酶切、连接和修饰.ppt

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1、第四章核酸分子的酶切、连接和修饰基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DN聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。第一节DNA分子的酶切第二节DNA分子的连接第三节DNA分子的修饰第一节DNA分子的酶切一、限制与修饰（Restrictionandmodification）二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端四、DNA末端长度对限制酶切割的影响五、位点偏爱(sitepreferences)六、酶切反

2、应条件七、星星活性(staractivity)八、单链DNA的切割九、酶切位点的引入十、内切酶对DNA的消化任何物种都有排除异物保护自身的防御机制人的免疫系统（immunitysystem）细菌的限制与修饰系统（restrictionandmodificationsystem）限制性内切酶修饰酶（modificationenzyme）一、限制与修饰20世纪50年代初，发现寄主控制的专一性（hostcontrolledspecificity）λ噬菌体表现的现象具有代表性和普遍性：λ噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其他宿主时会受到限制。1.限制与修饰现象λ噬菌体不同感

3、染株对E.coli不同菌株的感染率在生物体内，存在与限制酶对应的修饰酶，二者是同时存在的。限制酶和甲基化酶共同组成限制-修饰系统。2.限制酶的发现20世纪60年代,限制性酶切和限制酶的概念1968Linn和Arber首次从E.coliB中分离到限制酶1970Smith（美）偶然在流感嗜血杆菌发现限制性内切酶HindIIHindII限制性内切酶限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。3.限制酶的概念4.限制酶的命名宿主：属名第一字母，种名头两个字母；菌株

4、号或生物型号序号：罗马数字HindIIIEcoRI大肠杆菌（Escherichiacoli）流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。1986年下半年，615种限制酶&98种甲基化酶至2006年2月，3773种限制酶&810种甲基化酶5.限制酶的数量I型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。II类限制性内切酶III类限制性内切酶6.限制酶的种类(1)typeII93%识别回文对称序列（palindromesequenc

5、e），在序列内部或附近切割产生带3-OH和5-P基团的DNA产物需要Mg2+，修饰酶只需要S-腺苷甲硫氨酸（SAM）识别序列(recognitionsequence)主要为4~6bp,但有少数酶识别更长的序列或简并序列切割位置因酶而异，有些是隔开的R：一般为同源二聚体（homodimer）,反向结合作用在两条链，同时切割DNA双链M：单体，只作用于新链1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同源二聚体的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG(2)typeIIs5%识别位点非对称，非间断，4~7bp切割位点可能在识别位点一侧的2

6、0bp范围内R：与typeII具有相同的辅助因子要求M：通常由两个甲基化酶来完成，各作用一条链R酶和M酶各作为一个亚基存在于酶分子中，即R亚基和M亚基,还有负责识别DNA序列的S亚基它们分别由hsdR,hsdM,hsdS基因编码，属于同一操纵子（operon）（转录单位）如EcoK和EcoB,EcoKR2M2S和EcoBR2M4S2EcoK和EcoB的切割位点在识别位点1000bp以外，且无特异性(3)typeI1%如EcoP1和EcoP15识别位点分别是AGACC和CAGCAG切割位点在下游24~26bp处(4)typeIII<1%识别序列：限制性核酸内切酶在双

7、链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。为了便于书写，识别序列可以以5'→3'走向的单链DNA表示。切割位点：DNA在限制性内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置称为切割位点，用↓或∕表示。1.识别序列的长度:4~8bp,最常见6bp4:Sau3AIGATC5:EcoRIICCWGGNciICCSGG6:EcoRIGAATTCHindIIIAAGCTTW=A或TS=G或CBbvCⅠ  CCTCAGCNotⅠGCGGCCGC7：8：2.识别序列的结构①回文对称（parlindrome）②非对称（non-sysmmetria）AccBSICCG

8、CTCGG