免疫组化基本技术(三).ppt

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1、免疫组化基本技术（三）6.根据本实验室经验各种不同类型组织的石蜡包埋条件(1)大动物组织（狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％乙醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ1

2、5min,Ⅱ10min，Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸蜡时间75％乙醇30min，85％乙醇1h，95％乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h和Ⅲ4h或过夜，无水乙醇Ⅰ30min，Ⅱ1～2h和Ⅲ4h，二甲苯Ⅰ30min，Ⅱ30min和Ⅲ1h。七、组织切片切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。1.切片前的准备工作(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。(2)切片粘合剂的种类多聚

3、赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片→丙酮5min→APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。铬矾明胶液：铬矾0.5g明胶5gH2O21000ml甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml明胶0.5gH2O2100ml2.石蜡切片：3.冰冻切片：IHC冰冻切片，ISH冰冻切片(恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机)4.切片要求及注意事项：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)52－60℃烤片18h。(3)切片厚2～4μm。(4)切片刀要快(5)编上号(6)

4、切片可在4℃保存数年（石蜡切片）(7)冰冻切片需凉干后立即固定(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h，冰冻切片。(9)冰冻切片固定后-80℃保存备用八、组织与细胞材料的保存1.冷冻保存：-80℃，-145℃，-198℃组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管中，-80℃冻存。3.蜡块的保存4.活细胞的保存可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。第二部分IHC的一些基本技术主要内容一、实验的设计二、石蜡切片的脱蜡至水三、内源性

5、酶的消除方法四、IHC的非特异性染色五、抗原的暴露和修复六、抗体的购置及注意事项七、抗体最佳稀释度的测定和保存八、显示系统及衬染剂的选择和配制九、IHC常用缓冲液一、实验的设计1.查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。2.列出IHC实验操作流程，选择何种IHC前处理方式。3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，应设置何种对照。4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育时间和温度，同一的显色时间。5.列出阳性判定的标准6.预期达到的目标二、石蜡切片脱蜡至水冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需

6、经如下脱蜡才能做IHC。二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯Ⅲ10min，无水乙醇2min，95％乙醇2min，85％乙醇2min，75％乙醇2min，流水冲洗。三、内源性酶的消除方法(一)内源性过氧化物酶的消除方法：1.0.3%～3%H2O2甲醇液20min2.1％H2O220min3.3％苯肼溶液37℃1h4.0.075%盐酸甲醇液30min5.DAB-H2O2溶液中加0.005MNaN3过碘酸-硼酸钠：0.5%过碘酸10min，经洗后1％硼酸钠处理10min。7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸30～60min。