全章复习与测试.pptx

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1、探究MoTlg2（M）基因在稻瘟菌菌丝极性生长中的作用机理李超2019.3.22背景资料1稻瘟菌(Magnaportheoryzae)侵染水稻引起的稻瘟病是水稻最重要的真菌病害之一研究稻瘟菌菌丝生长相关机理,有助于深入揭示稻瘟菌致病的分子机理、从而发现靶标基因用于新农药的设计和筛选,达到控制病害的目的已知稻瘟病菌的全基因组序列已被完全测定；同时，已知M基因对菌丝生长起重要作用，且广泛存在于酵母等丝状真菌中6000万人背景资料1稻瘟菌(Magnaportheoryzae)侵染水稻引起的稻瘟病是水稻最重要的真菌病害之一研究稻瘟菌

2、菌丝生长相关机理,有助于深入揭示稻瘟菌致病的分子机理、从而发现靶标基因用于新农药的设计和筛选,达到控制病害的目的已知稻瘟病菌的全基因组序列已被完全测定；同时，已知M基因对菌丝生长起重要作用，且广泛存在于酵母等丝状真菌中材料信息1稻瘟菌野生型菌株P131M基因在P131基因组中的位置情况图1野生型稻瘟菌菌株P131的菌落形态（5d）问题1：如何用实验证明M基因在稻瘟菌菌丝生长中的作用问题2：用什么生物学技术可以将M基因敲除掉，涉及几个步骤？图2M基因在野生型稻瘟菌菌株P131基因组中的位置P131背景资料2图3同源重组原理示意

3、图应用基因同源重组法敲除基因可以研究某一基因的功能同源重组在细胞中自然发生，交叉互换的位点必须发生在特定的同源序列中材料信息2稻瘟菌野生型菌株P131和P质粒NEOHPTOri图4P质粒基因结构示意图注：为基因的转录方向SpeI、Sal等为限制酶LB为M基因上游的同源序列RB为M基因下游的同源序列NEO为抗新霉素基因HPT为抗潮霉素基因P131按照基因工程的基本操作程序，应用同源重组的原理，用P质粒载体上的抗潮霉素（HPT）基因替换稻瘟菌基因组中的Ｍ基因，实现M基因敲除主要任务1.获取目的基因获取哪段序列作为目的序列？什么方

4、法获取？注：为基因的转录方向SpeI、Sal等为限制酶LB为M基因上游的同源序列RB为M基因下游的同源序列NEO为抗新霉素基因HPT为抗潮霉素基因P131NEOHPTOri图4P质粒基因结构示意图2.构建基因表达载体注：为基因的转录方向SpeI、Sal等为限制酶LB为M基因上游的同源序列RB为M基因下游的同源序列NEO为抗新霉素基因HPT为抗潮霉素基因P131选用什么工具？什么工具酶？构建过程的顺序？NEOHPTOri图4P质粒基因结构示意图2.构建基因表达载体P131NEOHPTOri图4P质粒基因结构示意图步骤1NEOH

5、PTOriRBHindIII、SalI2.构建基因表达载体P131步骤2SpeI、PstINEOHPTRBOriNEOHPTRBOriLB3.导入受体细胞P131注：为基因的转录方向SpeI、Sal等为限制酶LB为M基因上游的同源序列RB为M基因下游的同源序列NEO为抗新霉素基因HPT为抗潮霉素基因用NotI将重组质粒线性化，导入野生型P131受体细胞初步筛选？NEOHPTRBOriLB敲除突变体P13140mm34mm导入受体细胞后，获得的转化子打孔5天之后测量菌落直径的结果4.目的基因的检测与鉴定敲除突变体P13140m

6、m34mm4.目的基因的检测5’3’3’5’DNA分子杂交4.目的基因的鉴定P131哪个样品是真正的M基因敲除体？10.2kbM2.1kb注：用XhoI切基因组用RB作为探针样品1样品2P131M基因敲除突变体M基因在菌丝极性生长中的作用机理背景资料3：顶体结构是真菌的菌丝顶端的一个动态结构，它与菌丝的极性生长有关。FM464是一种内吞性染料，它可以进入顶体，从而证明内吞囊泡参与了顶体囊泡的积累。用该染料同时对野生型和敲除体的顶端进行染色观察，结果如下图所示。请根据如下结果说明M基因的作用机理。图5FM464染色的结果