血清碱性磷酸酶活性测定.ppt

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1、血清碱性磷酸酶活性测定磷酸苯二钠法小组成员：程展鹏，杨秋月，陈敬根，卢昆实验目的熟悉酶活性测定方法的一般原理掌握血清ALP测定原理与临床意义实验原理在PH10环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。测定红色物质的吸光度就可以计算酶活性的大小。反应式如下：ALP磷酸苯二钠+H2O——苯酚+磷酸氢二钠pH10铁氰化钾苯酚+4-氨基安替比林————红色醌亚胺衍生物实验器材和试剂：（一）器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，7

2、21E分光光度计，1cm比色皿，37℃恒温水浴（二）试剂：1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0)称取无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，加蒸馏水溶解至1000ml。置棕色瓶中保存。2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液先将400ml蒸馏水煮沸，称取磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g)加入煮沸的蒸馏水中使其溶解，冷却后用煮过的冷蒸馏水加至500ml，再加氯仿2ml，置冰箱保存，此为底物溶液。3．铁氰化钾的硼酸溶液称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两

3、液混合后，加蒸馏水至1000ml，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。4．酚标准工作液（0.05mg/ml）：购买合格的二级标准品。实验操作取试管4支，按下表操作：测定管标准管空白管对照管血清（ml）0.100——————酚标准液——0.100————蒸馏水————0.100——pH10碳酸盐缓冲液1.001.001.001.00混匀37摄氏度水浴保温5MIN同时将底物预热底物液1.001.001.001.00混匀37摄制度水浴保护15min铁氰化钾溶液3.003.003.003.00血清———————0.100立即混匀。用510nm波长

4、比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。计算ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白）*0.05*100(金氏单位）标准曲线法制备如下：取试管6支，分别加酚标准液(1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图

5、，绘制成标准曲线。临床意义在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。1．血清ALP活性升高：肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。2．血清ALP活性降低：比较少见，主要见于呆小病，ALP过少症，维生素C缺乏症。注意事项1．底物溶液中不应含有游离酚，如有酚则空白管显红色，说明磷酸苯二钠已经开始分解，应弃去不用。2．铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳

6、定显色作用。该液应避光保存，如出现蓝绿色即应废弃。3．加入铁氰化钾溶液后必须立即混匀，否则显色不完全。