血清碱性磷酸酶活力测定

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1、血清碱性磷酸酶活力测定(磷酸苯二钠法)酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应的能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。底物减少量或生成物增加量酶促反应速度=单位时间酶的活力单位国际单位：Katal，1s转化1mol底物的酶量临床表示：Kings，如血清谷丙转氨酶活力单位，每100ml血清在37℃。pH=7.4的条件下与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸所需的酶量为1个活力单位酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活力单位数，即酶活力浓度。酶

2、活力的测定方法1.终止测定法（定时法或终点法）2.动力学分析法（连续监测法或速率法）实验目的熟悉酶活性测定方法的一般原理掌握血清ALP测定原理与临床意义实验原理碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。磷酸苯二钠+H2O苯酚+磷酸氢二钠苯酚+4-氨基安替比林红色醌亚胺衍生物ALPpH=10铁氰化钾实验器材和试剂：（一）器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，721E分光

3、光度计，1cm比色皿，37℃恒温水浴（二）试剂：1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0)称取无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g)，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）3．铁氰化钾的硼酸溶液称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加

4、蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。4．酚标准工作液（0.05mg/ml）：购买合格的二级标准品。实验操作1.取试管4支，按下表操作测定管标准管空白管对照管血清（ml）0.100——————酚标准液——0.100————蒸馏水————0.100——pH10碳酸盐缓冲液1.001.001.001.00混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热底物液1.001.001.001.00混匀，37℃水浴保护15min铁氰化钾溶液3.003.003.003.00血清———————0.1002.立即混匀。在510

5、nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。计算ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白）*0.05*100(金氏单位）临床意义：血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。1．血清ALP活性升高可能原因如下：①肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；②骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。2．血清ALP活性降低比较少见：主要见于呆小病、重症

6、慢性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。注意事项目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久置底物液中不应含有酚，如空白管显红色，说明磷酸苯二钠已分解，不宜使用。加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则对实验结果会有影响。标准曲线法制备如下：取试管6支，分别加酚标准液(1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长

7、下比色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。