实验三 酵母核酸的制备及成份鉴定.ppt

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1、实验三酵母核糖核酸的提取及组分鉴定(先打开水浴锅,温度设置成100摄氏度)一、目的二、原理三、器材四、试剂和材料五、操作六、注意事项一、目的了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法以了解苔黑酚定量测定RNA的方法。二、原理酵母核糖核酸中RNA含量较多，RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，即得到RNA的粗制品。核糖核酸中含有核糖、嘌呤碱，嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。1.磷酸磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（Vc）存在时可被还原成蓝色的钼蓝

2、。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。2.嘌呤碱根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。3.戊糖根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。三、器材锥形瓶大研钵电子天平离心机恒温水浴锅注意仪器使用方法离心管平衡!!四、试剂和材料酵母粉0.04MNaOH,95%乙醇,1.5MH2SO4溶液,浓氨水,0.1MAgNO3酸性乙醇溶液：30ml95%乙醇加0.3ml浓盐酸混匀。苔黑酚--FeCl3溶液：将100mg苔黑酚溶于

3、100ml浓HCl中,再加入100mgFeCl3.6H2O，临用时配制。定磷试剂：按顺序以A：B：C：蒸馏水＝1：1：1：2（V/V）混匀,现配。A、17%H2SO4：将17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。B、2.5%（NH4）6Mo7O24：2.5g（NH4）4Mo2O7溶于100ml蒸馏水中。C、10%Vc：10gVc溶于100ml蒸馏水中，用棕色瓶贮存。颜色呈淡黄色时可以使用，如呈深黄或棕色则失效。五、操作1、酵母RNA的提取(2-3人一份)将4g酵母溶于20ml0.04MNaOH溶液中（先以少量NaOH溶液湿润酵母，并充分研磨)，将悬浮液转

4、移到250ml锥形瓶中，在沸水浴30分钟，不时搅拌,冷却后转入离心管进行离心.----（蛋白质变性沉淀，RNA溶于碱性溶液）离心10min（4000rpm),将上清液倾入10ml酸性乙醇溶液中，待核糖核酸沉淀完全后，离心3min（4000rpm），弃去上清。---RNA不溶于乙醇，pI=2.5）用95%乙醇洗涤沉淀，离心3min（4000rpm）弃去上清液，共进行两次。沉淀可在空气中干燥，即为酵母RNA的粗制品。五、操作2、RNA水解液的制备：取200mg提取的核酸，加入1.5MH2SO410ml，在沸水浴中加热10分钟后制成水解液并进行组分的鉴定

5、。3、RNA组分的鉴定：①嘌呤碱：取水解液1ml加入约1ml　0.1MAgNO3溶液,然后加入过量的浓氨水，观察溶液的变化。②核糖：取1支试管加入水解液1ml，加三氯化铁-盐酸溶液2ml，再加苔黑酚溶液0.2ml，放沸水浴中10分钟，注意溶液颜色的变化。③磷酸：取1支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在水浴中加热，观察溶液颜色的变化。(浓氨水FeCl3-浓HCl定磷试剂在通风柜中)六、注意事项1.先以少量NaOH溶液湿润酵母，并进行充分研磨，再用剩余的NaOH溶液冲洗研钵一起转入离心管。提取时,注意每个步骤的目的和意义2.思考题：为什么提

6、取率各组间会出现较大的差异3.完成实验报告