淀粉酶活性测试.pptx

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1、淀粉酶活性测试淀粉酶活力的测定Ⅰ一、测试原理：淀粉遇碘产生蓝色，可以在一定量的淀粉中加入不同量的淀粉酶制剂，一定时间后，不出现蓝色且酶制剂用量最少的那个试液可以认为刚好将淀粉全部分解，可根据酶制剂的用量、淀粉的用量以及反应时间来计算该淀粉酶的活力。二、仪器与试剂1.仪器恒温水浴锅；比色管(或试管)；温度计。2.淀粉试液分别称取可溶性淀粉50g(精确至0.01g)和食盐5g,用少量蒸馏水分别溶解后，移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。0.1mol/L的碘液：碘溶液：称取1.3g碘片及

2、3.5g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中，在棕色瓶中保存。酶制剂溶液：称取(精确至0.01g)淀粉酶制剂25g(或吸取25mL)，溶解后移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。三、操作步骤在已编号的10只比色管中分别加人5mL淀粉试液，另取一只比色管，内盛蒸馏水，插入温度计。一起放人恒温水浴锅中保温(BF-7658酶60℃，胰酶40℃)，当温度恒定在所需温度后，按管号分别加入1.0-1.9mL(间隔为0.1mL)配制好的酶制剂溶液，计时保温60min。60min后，在每管中加人数滴0.1

3、mol/L碘溶液。记录不呈蓝色且加入酶制剂溶液最少的试管中加入酶制剂溶液的体积V(mL)。四、计算酶活力=[mg/(g·h)]=W1×5／(W2/1000)×V×1=5000W1／W2×V式中：wl——称取淀粉的质量，g；W2——称取酶制剂的质量，g；V——不呈蓝色试管中淀粉酶用量最少所加酶制剂溶液的体积，mL。五、说明①由于酶制剂的活力变化较大，如完全按上述操作，所加酶制剂溶夜体积可能不一定在测试范围中，因此可以先加大酶制剂溶液体积的间隔，找到一个大致用量，再在其左右用0.1mL的间隔较精确测定使淀

4、粉刚好完全分解时所加入酶制剂溶液的体积。②酶活力也可用酶的转化力来表示，即计算每小时每克(或毫升)酶制剂转化淀粉的克数。淀粉酶活力测定Ⅱ一、原理酶作用于淀粉溶液生成还原糖，然后加入费林制剂，在加热的情况下，定量地生成氧化亚铜沉淀。在加入碘化钾和硫酸后，生成游离碘，此时，立即用硫代硫酸钠溶液滴定。二、试剂和溶液30%碘化钾溶液：碘化钾150g溶解于水350ml中，保存在褐色试剂瓶中，避免阳光直射；25%硫酸溶液：硫酸125g溶于375ml水中；0.05mol/L硫代硫酸钠溶液：将滴定分析用的0.1mol

5、/L硫代硫酸钠500ml用煮沸过的冷却水稀释，所得溶液的中体积为1000ml。配制好后，应进行标定，求出浓度校正系数f值；1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.0）：将1mol/L乙酸钠溶液加入到1mol/L的乙酸溶液中，调pH到5.0。可溶性淀粉溶液（pH5.0）：将可溶性淀粉（试剂级）在105℃干燥4h后称量计算含水量。然后，根据可溶性淀粉的含水量称取0.50g（折干）的可溶性淀粉，缓慢加入到沸水50ml中，煮沸5min，用自来水冷却后加入1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.0）5ml用

6、水定容至100ml。费林试剂----铜溶液：硫酸铜34.66g溶解在水中，定容至500ml----酒石酸钾钠碱溶液：酒石酸钾钠173g和氢氧化钠50g溶解在水中，定容至500ml；----使用前，精确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。三、操作3.1样品溶液的制备用水稀释酶样品，使得到酶也的（T0-T30）×f×1.62值为3mg-6mg葡萄糖量。示例：真菌α-淀粉酶：[n=50000]稀释1ml→250ml，再稀释1ml→200ml3.2测定将可溶性淀粉溶液10ml加到100m三角瓶中，置于（40±0

7、.5）℃恒温水浴中。预热10-15min,加入样品稀释酶液1ml。准确加热30min后。加入费林试剂4ml使酶失活。将三角烧瓶直接在煤气喷灯（或电炉）上加热2min后，立即放在自来水中冷却。随后，加入30%碘化钾溶液2ml和25%硫酸溶液2ml，用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定游离出的碘，以蓝色消失作为滴定终点T30（ml）空白对照实验：以水取代酶液。在另一个三角烧瓶中用上述同样的操作步骤测定空白对照值T0(ml)。临近终点时，加入1%可溶性淀粉溶液1-2滴，以蓝色消失作为滴定终点。四、计算在本

8、条件下，反应30min，反应液中产生相当于10mg葡萄糖的还原糖所需的酶量，定义为一个淀粉糖化酶活力单位。淀粉糖化酶活力按下式计算淀粉糖化酶活力（u/ml）=（T0-T30）×f×1.62×1/10×n式中：T30----酶反应液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mlT0----空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mlf----0.05mol/l硫代硫酸钠溶液浓度的校正系数1.62----换算系数1/10----该分析方法的常数（相当于10mg葡萄