XY09 05沉淀.ppt

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1、第四章沉淀Precipitation（沉淀）Electricaldoublelayer（双电层）与结晶的区别？主要内容：知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法。重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。难点：常用沉淀方法的灵活运用。概述沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将

2、已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。沉淀法生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。操作方式沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到

3、的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：①首先加入沉淀剂，②沉淀剂的陈化，促进粒子生长；③为离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）高价金属离子沉淀法等。上述各种方法

4、中，除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子，故以下的讨论均限于蛋白质。第一节蛋白质表面特性蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。蛋白质表面构成蛋白质是两性高分子电解质（amphotericpolymer），主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势

5、，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域沉淀屏障1、蛋白质周围水化层（hydrationshell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。2、蛋白质分子间的静电排斥作用（存在双电层）结论：实现蛋白质沉淀可通过降低蛋白质周围水化层和双电层厚度，降低蛋白质溶液的稳定性。蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质可以看作是

6、一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。★静电斥力★吸引力蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离，因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在，蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。（凝聚）蛋白表面的双电层（图1）蛋白表面的双电层（图1）吸引力颗粒间的相互作用颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。VanderWaals力Keeson引力

7、（偶极力）Debye引力（诱导力）London引力（色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。离子强度与两颗粒间的作用能的关系图DLVO理论颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。第二节盐析沉淀概念

8、（1）、什么是盐析？蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象。Cohn经验方程（2）、电解质对蛋白质溶解度的影响。盐溶(salting-in)：电解质浓度低时盐析（salting-out)：电解质浓度高时1、中性盐盐析法早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、