脲酶活力测定(纳氏试剂比色法).doc

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1、实验四脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH7.0。反应式：(NH2)2CO+H2O脲酶2NH3+CO2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。反应式：NH3·H2O＋2K2HgI4+3KOHHgO·HgNH2I＋7KI+3H20（纳氏试剂）（碘化氨氧合汞）二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。按下表步骤加入实验制备的酶液及试剂：试管号步骤123

2、（1）适当稀释的待测酶液（mL）（2）标准硫酸铵溶液（mL）（3）蒸馏水（mL）（4）1mol·L-1H2SO4（mL）002.001.0000.301.701.001.0001.000（5）25°C恒温水浴中平衡5min。（6）3%尿素（mL）1.001.001.00（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min，立即向样品管（3号管）加1mol·L-1H2SO41.00mL，终止反应。（8）另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色。①　反应液（mL）②　蒸馏水（mL）③　纳氏试剂（mL）0.204.300

3、.500.204.300.500.204.300.50（9）各管混匀后，30min内，用分光光度计测试：比色记录A260nmA1A2A3三、结果计算脲酶活力（U·mL-1)=(A3-A1）*标准管中的NH3微摩尔数(A2-A1)*min*酶样品毫升数式中：n为酶样品的稀释倍数四、仪器和试剂1、分光光度计、恒温水浴器、试管等。2、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。3、3％尿素底物溶液：3g高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL。4、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：

4、6.70gNa2HPO4·2H2O,3.25gKH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100mL。5、1mol·L-1H2SO4溶液：56mL浓硫酸，缓慢加入盛有约600mL蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。6、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL。此溶液含NH3为40μmol·mL-1。7、纳氏试剂：分别溶解3.5g氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为

5、止。向此液中加70mL30%KOH，不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。混匀，静置过夜，倾出清液贮于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。在有碘化汞情况下，可溶10gHgI2和7gKI于少量蒸馏水中，另溶16gNaOH于50mL水中，待冷却后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水定容至100mL。过夜澄清后，倾出上清液存于棕色试剂瓶中。（配置方法之二）