elisa的检测原理及步骤.doc

《elisa的检测原理及步骤.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、ElisaKit使用方法检测原理:本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。试剂盒组成：1．抗体预包被酶标板（8×12或8×6）2．冻干标准品（2

2、/1支；0.5ng/支）3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1瓶；20ml/12ml）4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1支）5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1瓶；16ml/10ml）6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1支）7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1瓶；16ml/10ml）8．浓缩洗涤液20×（白盖瓶）（1瓶；50ml/25ml）9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1瓶；12ml/6ml）10．反应终止液（红盖瓶）（1瓶；12ml/6ml）11．封板胶纸（6/3张）12．产品说明书（1份）标本收集:1.收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。2.血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免

3、使用溶血，高血脂标本。3.标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。4.标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。5.如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。注意事项:1.试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。2.浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5

4、次使溶液混匀。3.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。4.若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻融。5.不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。6.充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。7.在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。8.试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试验结果。9.试验中请穿着试验

5、服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时，请按国家生物试验室安全防护条列执行。检测前准备工作:1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2.将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。3.标准品:加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0pg/ml)。复溶标准品原液（1000pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的

6、标准品请废弃。4.生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）5.酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足，可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号）洗涤方法:1.自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔15－30秒。洗板5次。2.手工洗板：甩尽孔内液体，在洁

7、净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。操作步骤:1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃。2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。4．洗板5次。5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul