elisa方法的及步骤

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1、香港生科仪有限公司BiosciEquipSupplyInternationalCo.，Limited——————————————————————————————————————————一、ELISA方法的及步骤：ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。　　(一)　原理　　ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结

2、合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。　　(二)　操作步骤　　方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:　　1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／m

3、l。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。　　6.　结果判定：可于白

4、色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。　　方法二　用于检测未知抗体的间接法：　　　　　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，　　　　　　每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔　　　　　　中,置

5、37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)　　　　　　　　　　　　　　↓___________________________________________________________________________________北京办事处北京市海淀区吴家场路1号唐宁府4号楼1单元404室邮编100036.电话及传真:010-63955306;13661397601;email:jclrm@vip.sohu.com;Web：www.biosciequip.com香港生科仪有限公司BiosciEquipSupplyInternationalCo.

6、，Limited——————————————————————————————————————————　　　　　　于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，　　　　　　37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。　　(三)　试剂器材　　1.　试剂　　(1)　包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液):　　　　　　NaCO３1.59克　　　　　　NaHCO３　2.93克　　　　　　加蒸馏水至1000ml　　(2)　洗涤缓冲液(PH7.4PBS)：0

7、.15M　　　　　　KH2PO4　　　　　0.2克　　　　　　Na2HPO４·12H2O　　2.9克　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml　　　　　　加蒸馏水至1000ml　　(3)　稀释液：　　　　　　　牛血清白蛋白(BSA)0.1克　　　　　　　加洗涤缓冲液至100ml　　　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。　　(4)　终止液(2M　H２SO４）：　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。　　(5)　底物缓冲液(PH