胡萝卜组培实验.ppt

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1、植物组织培养实验【实验目的】熟悉植物组织培养流程了解培养基的配制方法掌握无菌操作技术【实验原理】植物组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。其理论依据是植物细胞具有全能性。【实验材料及仪器】实验材料：胡萝卜实验器材：高压灭菌锅，超净工作台，电子天平，酒精灯，三角瓶，镊子，剪刀，手术刀，烧杯实验药品：配制MS培养基的各种试剂，蔗糖，琼脂，0.1%升汞（本实验采用次氯酸钠），2,4-D，6-BA，NaOH，HCl等【实验步骤】1.MS培

2、养基母液的配制按照表1配制MS培养基母液表1.MS基本培养基的配制成分母液MS培养基大量元素NH4NO3KNO3CaCl2·H2OKH2PO4MgSO4·7H2Omg/L(100×)165000190000440001700037000mg/L16501900440170370微量元素mg/L(100×)mg/LMnSO4·4H2OZnSO4·4H2OH3BO3KINa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2O223086062083252.52.522.38.66.20.830.250.0250.025铁盐Na2EDTAF

3、eSO4·7H2Omg/L(100×)37252785mg/L37.2527.85有机物质甘氨酸硫胺素烟酸盐酸吡哆醇肌醇mg/L(100×)20040505010000mg/L2.00.40.50.5100MS培养基的配制取1000ml烧杯，分别取各种成分的母液100ml，加入烧杯，称取蔗糖30g，琼脂6.5g，按照需要的浓度分别加入各种植物生长调节剂（2,4-D浓度1mg/L+6-BA浓度0.5mg/L），加水至800ml。加热使琼脂溶解，定容至1000ml，用10％NaOH调节pH至5.6~5.8。培养基及材料灭菌将配好的培养基迅速分装至

4、50ml三角瓶中，用棉花塞好，用牛皮纸或报纸包扎（本实验采用封口膜封口）。放入高压灭菌锅中，121℃、灭菌20min。培养基及材料灭菌无菌水：用500mL三角瓶，加入约300mL蒸馏水，封口膜封口，121℃、灭菌20min。无菌滤纸、无菌瓷砖：将实验所需滤纸、瓷砖等用包装包好，121℃、灭菌20min。剪刀、镊子、解剖刀灭菌：可直接在酒精灯上燃烧进行灭菌。正式接种前30min，打开超净工作台上的紫外灯和风机，30min后接种；上超净台的第一件事是关闭紫外灯并打开照明灯；把解剖刀、镊子、解剖针等器械浸泡在75％酒精中；点燃酒精灯；用75％的酒精

5、棉球擦拭双手；外植体的消毒：将胡萝卜用自来水充分洗净削去外皮切成10cm段,置于超净工作台上用75%酒精浸洗30s,无菌水冲洗2～3次,再用2.5%次氯酸钠溶液处理30min,无菌水冲洗3～5次。超净台上操作（１）用酒精棉球擦手，然后点燃废酒精棉球擦拭超净台工作台面。取出一张无菌滤纸，放在面前。将无菌瓷砖打开包装，置于无菌滤纸旁边。（２）用酒精灯火焰烧灼刀柄、刀片、镊子等，置于瓷砖上冷却后置于无菌滤纸上。（３）用无菌的镊子夹取一条无菌的胡萝卜，用无菌解剖刀把胡萝卜形成层部分切成1cm3小块。（4）取一瓶培养基，除去橡皮筋，揭开封口膜，把培养基

6、放在紧靠酒精灯火焰无菌区的后方。（5）用无菌镊子夹取胡萝卜小块，接种于MS培养基上，每瓶接种6块外植体。注意无菌操作。（６）盖好封口膜，缠好皮筋，用记号笔在培养瓶封口膜上写好班级姓名。放入培养箱，25℃暗培养7-10天后观察记录。【注意事项】1、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；2、配制贮存母液时，要计算好各种成分扩大倍数后逐次加入，在第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机成分配好后要装入棕色瓶中在冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保存，但最多不能超过一个月；3、pH值对培养基的硬度有影响，

7、pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值；4、材料消毒时不要在酒精中停留过长时间；5、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行7-10d的暗培养，然后再进行光照培养。思考题1.植物组织培养的理论基础是什么？2.培养基的成分主要有哪几类？